本文選題：酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine　切入點(diǎn)：Kinase　出處：《浙江大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究目的： 評價新型多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑AL-8326的體內(nèi)外抗腫瘤活性,并研究AL-8326發(fā)揮抗腫瘤活性的潛在分子機(jī)制。 研究方法： 1.AL-8326的體內(nèi)外抗腫瘤活性評價：1)體外抑制細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,懸浮細(xì)胞采用四氮唑鹽還原法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT),貼壁細(xì)胞采用磺酰羅丹明B蛋白染色法(Sulforhodamine B, SRB)來觀察AL-8326對16株腫瘤細(xì)胞(包括2株卵巢癌細(xì)胞,4株白血病細(xì)胞,2株乳腺癌細(xì)胞,1株肺癌細(xì)胞,3株肝癌細(xì)胞,1株腎癌細(xì)胞,1株宮頸癌細(xì)胞,1株結(jié)腸癌細(xì)胞以及1株胃癌細(xì)胞)體外增殖抑制作用。2)建立人白血病HL-60、人卵巢癌SKOV3、人肝癌Bel-7402以及人宮頸癌Hela裸小鼠移植瘤模型,評價AL-8326的體內(nèi)抗腫瘤活性。 2.AL-8326的抗腫瘤作用機(jī)制研究：1)ELISA法測定AL-8326是否為ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑。2)Western bloting法檢測AL-8326對經(jīng)hVEGF165. b.FGF刺激后內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)VEGFR.FGFR下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子Erkl/2.Akt的磷酸化影響。3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Annexin V-FITC/Propidiumiodide(PI)染色檢測AL-8326作用腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況。4)Western blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。5)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Propidium iodide(PI)染色檢測細(xì)胞經(jīng)AL-8326作用細(xì)胞后對細(xì)胞周期的影響。6)Western blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)周期相關(guān)蛋白cdc25B.cyclin B和cdc2的表達(dá)情況。7)采用激酶檢測試劑分析AL-8326對Aurora-A/B/C的抑制作用。8)雞胚絨毛尿囊膜法(CAM)檢測AL-8326對新生血管生成的影響。9)HUVEC細(xì)胞Transwell小室遷移模型及劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測AL-8236對細(xì)胞侵襲能力的影響。 研究結(jié)果： 1.AL-8326在體內(nèi)外具有廣譜高效的抗腫瘤活性：1)AL-8326對16種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的體外抑制增殖作用,作用72h后半數(shù)抑制濃度(IC50值)分別為：卵巢癌細(xì)胞SKOV3(17.1±0.57μM)、卵巢癌細(xì)胞A2780(2.32±0.11μM)、急性髓性白血病細(xì)胞HL.60(4.84±0.45μM)、急性淋巴性白血病細(xì)胞Molt-4(4.85±1.43μM)、慢性髓性白血病細(xì)胞K562(6.62±0.29μM)、淋巴瘤細(xì)胞U937(10.0±2.28μ)、乳腺癌細(xì)胞SKBR3(12.2±2.00μM)、乳腺癌細(xì)胞MDA.MB.231(7.77±0.02μM)、高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95-D(4.92±2.26μM)、肝癌細(xì)胞BEL-7402(2.04±1.91μM)、肝癌細(xì)胞HepG2(8.29±2.32μM)、肝癌細(xì)胞SMMC.7721(8.51±1.61μM)、腎癌細(xì)胞786-0(10.1±3.97μM)、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116(10.4±3.18μtM)、宮頸癌細(xì)胞Hela(11.2±2.71μM)和胃癌細(xì)胞SGC7901(6.24±0.90μM)。AL-8326對16株腫瘤細(xì)胞的平均IC50值為7.96±1.63μM。同時,陽性對照藥Sunitinib對16株腫瘤細(xì)胞的平均IC50值為6.13±1.72μM。結(jié)果說明,AL-8326具有廣譜體外抗腫瘤活性,對多種腫瘤細(xì)胞的體外增值抑制作用稍弱于陽性對照藥Sunitinib。2)采用人白血病HL-60裸小鼠移植瘤模型,評價AL-8326體內(nèi)抗腫瘤活性,給藥14天后,陽性對照藥Sunitinib45mg/kg組、AL-832645mg/kg、AL-832615mg/kg、 AL-83265mg/kg組腫瘤抑瘤率(%)分別為48.8%、84.2%、74.0%和47.9%,T/C值分別為74.8%、24.1%、36.3%、64.8%。采用人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型,評價AL-8326體內(nèi)抗腫瘤活性,給藥23天后,陽性對照藥Sunitinib45mg/kg組、AL-832645mg/kg、AL-832615mg/kg、AL-83265mg/kg組T/C(%)值分別為36.4%、12.9%、30.7%和72.0%,抑瘤率(%)分別為72.7%、89.6%,80.4%和38.1%；采用人肝癌Bel-7402裸小鼠移植瘤模型,評價AL-8326體內(nèi)抗腫瘤活性,給藥27天后,陽性對照藥Sunitinib45mg/kg組、AL-832645mg/kg、AL-832615mg/kg、AL-83265mg/kg組T/C(%)值分別為49.4%、26.2%、35.9%、53.3%,抑瘤率(%)分別為54.8%、74.7%、62.8%和47.5%；采用人宮頸癌Hela裸小鼠移植瘤模型,評價AL-8326體內(nèi)抗腫瘤活性,給藥19天后,陽性對照藥Sunitinib45mg/kg組.AL-832645mg/kg、 AL-832615mg/kg、AL-83265mg/kg組T/C(%)值分別為45.2%、23.3%、38.9%、58.0%,抑瘤率(%)分別為42.7%、76.9%、53.5%和27.9%；以上結(jié)果證實(shí),AL-8326在45mg/kg和15mg/kg劑量下均可顯著抑制HL-60、SKOV3、Bel-7402和Hela腫瘤的生長,并具有優(yōu)于相同劑量Sunitinib的體內(nèi)抗腫瘤活性。 2.AL-8326可從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、周期阻滯,抑制新生血管生成等方面發(fā)揮抗腫瘤活性：1)AL-8326是ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑：采用ELISA法證實(shí),隨著ATP濃度的增高(2、10、25、50、100、200μM),AL-8326對VEGFR-2的抑制能力呈ATP濃度依賴性降低,說明AL-8326是一種ATP競爭性的VEGFR-2抑制劑。2)Western blotting結(jié)果顯示,AL-8326能顯著抑制HUVEC細(xì)胞經(jīng)hVEGF165以及b-FGF刺激后VEGFR及FGFR下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子Erkl/2、Akt的磷酸化,且該作用強(qiáng)于相同濃度的陽性對照藥Sunitinib。3)Al-8326能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及產(chǎn)周期阻滯發(fā)揮抗腫瘤活性：選用5、10、15和20gμM AL-8326作用HL-60和SKOV3細(xì)胞48小時,流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60及SKOV3細(xì)胞凋亡率,分別為25.8%、41.9%、57.8%、78.5%和31.1%、48.0%、52.4%、58.3%,說明AL-8326能夠誘導(dǎo)HL-60和SKOV3細(xì)胞凋亡,且凋亡率呈濃度依賴性增加；同時,使用2.5、5、10、15和20μM AL-8326作用HL-60及SKOV3細(xì)胞24小時,能引起凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和PARP的切割及累積,且AL-8326對PARP的激活與同濃度的陽性藥Sunitinib相類似；流式細(xì)胞術(shù)檢測5、10和20μMAL-8326作用HL-60.SKOV3及U937細(xì)胞48小時后細(xì)胞周期變化情況,結(jié)果顯示,AL-8326可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞G2/M期阻滯,在5、10和20μM給藥情況下G2/M期所占百分率為28.5%、67.4%和70.4%,與同濃度的陽性藥Sunitinib相比,AL-8326引起G2/M期阻滯率稍高；同時,AL-8326可誘導(dǎo)HL-60和U937細(xì)胞形成多倍體,在5、10和20μM給藥條件下HL-60和U937形成的多倍體所占比率分別為87.4%、83.9%、18.3%以及13.7%、67.2%和66.4%,而陽性藥Sunitinib以及Taxol則不會產(chǎn)生該作用；2.5、5、10、15和20μMAL-8326分別作用HL-60及SKOV3細(xì)胞24小時,Western blotting結(jié)果顯示,AL-8326能引起cdc25B、cyclin B和cdc2的下調(diào),且AL-8326對cdc25B、cyclin B和cdc2的下調(diào)作用與同濃度的陽性藥Sunitinib相類似。4)AL-8326能夠抑制Aurora-B激酶活性：激酶分析結(jié)果顯示,AL-8326在分子水平能顯著抑制Aurora-B激酶活性,且具有明顯的濃度依賴性,半數(shù)抑制濃度(IC50)為47nM；而AL-8326對Aurora-A、Aurora-C激酶活性并沒有明顯的抑制作用(IC501,000nM).5)AL-8326能夠AL-8326抑制新生血管生成和細(xì)胞遷移：AL-8326對雞胚絨毛尿囊膜的新生血管形成具有顯著的抑制作用,與同濃度的陽性藥Sunitinib相比,AL-8326引起新生血管抑制作用更為明顯；HUVEC細(xì)胞Transwell小室遷移模型及劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)證明,AL-8326可以顯著抑制HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,且與同濃度的Sunitinib相比,AL-8326對HUVEC細(xì)胞的遷移能力抑制作用稍強(qiáng)。 結(jié)論： AL-8326具有廣譜的體外抗腫瘤活性,同時在體內(nèi)能發(fā)揮優(yōu)于上市藥物舒尼替尼(Sunitinib)的抗腫瘤活性。AL-8326對包括VEGFR,FGFR,PDGFR和Ret在內(nèi)的多種酪氨酸激酶具有抑制作用,且通過ATP競爭性與酪氨酸激酶結(jié)合,抑制激酶相關(guān)下游信號通路的激活,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡周期阻滯,同時AL-8326也可以通過抑制Aurora-B激酶活性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成多倍體從而發(fā)揮其抗腫瘤活性。此外,AL-8326還可以抑制新生血管生成并能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力。綜上所述,AL-8326是一個結(jié)構(gòu)全新、抗腫瘤作用明確且毒性反應(yīng)較小的多靶點(diǎn)小分子酪氨酸激酶抑制劑,完全具備進(jìn)一步開發(fā)成為新型抗腫瘤藥物的潛力,擁有很好的臨床應(yīng)用前景。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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1 玄香蘭;安昌善;周彩存;;肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)敏感非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼耐藥及機(jī)制的研究[J];中國肺癌雜志;2013年01期

2 朱孝峰,劉宗潮,曾益新;酪氨酸激酶受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腫瘤治療[J];藥學(xué)學(xué)報;2002年03期

3 鄧小強(qiáng);向明禮;賈若;楊勝勇;;選擇性的激酶ATP競爭性抑制劑設(shè)計研究進(jìn)展[J];藥學(xué)學(xué)報;2007年12期

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本文編號：1717432