本文選題：醛固酮　切入點(diǎn)：慢激活的延遲整流鉀電流　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：心肌肥厚、心衰時(shí)發(fā)生病理性電生理重構(gòu)使得心臟的電生理不穩(wěn)定性增加,常常伴發(fā)心律失常,心衰病人約一半以上因惡性心律失常的發(fā)生而猝死(即心性猝死Sudden cardiac death,SCD)。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在調(diào)節(jié)心血管功能中起著非常重要的作用,但是也可能導(dǎo)致各種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展,包括心肌肥厚和心力衰竭等。除了眾所周知的RAAS血管緊張素II的作用,越來(lái)越多的證據(jù)已經(jīng)表明,醛固酮除了通過(guò)作用于腎臟增加水和氯化鈉的重吸收,參與水電解質(zhì)平衡、血容量和血壓的調(diào)節(jié)以外,還通過(guò)作用于心肌細(xì)胞的鹽皮質(zhì)激素受體在心血管疾病的病理發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。兩個(gè)著名的臨床實(shí)驗(yàn)(RALES和EPHESUS)顯示,在利尿劑和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等經(jīng)典治療的基礎(chǔ)上再加用醛固酮拮抗劑治療可以顯著降低心衰患者或急性心肌梗死患者SCD的發(fā)生率,提示醛固酮可能通過(guò)作用于鹽皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)對(duì)心臟離子通道的調(diào)節(jié),從而導(dǎo)致心律失常。心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位延長(zhǎng)是心肌肥厚、心衰最典型的電生理重構(gòu)特征。心室復(fù)極過(guò)程延遲容易產(chǎn)生早后除極,加上復(fù)極不同步造成心室跨壁離散度增大引發(fā)興奮折返,為快速性室性心律失常創(chuàng)造了條件。很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)減少去極化K+電流是動(dòng)作電位延長(zhǎng)的重要原因。延遲整流鉀電流在復(fù)極過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,它包括快延遲整流鉀電流(IKr)和慢延遲整流鉀電流(IKs)。人心臟IKr由HERG(human ether-a-go-go-related gene)基因編碼。IKs由KCNQ1編碼的α亞單位和KCNE1編碼的β亞單位組成的異源多聚體。已經(jīng)證明HERG、KCNQ1、KCNE1基因突變是離子通道病的基礎(chǔ)。IKr和IKs下調(diào)是心肌肥厚、心衰動(dòng)作電位延長(zhǎng)的重要原因。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),RAAS中的重要成份血管緊張素II通過(guò)AT1受體下調(diào)IKr。盡管有研究表明醛固酮上調(diào)心室肌細(xì)胞L-型和T-型Ca2+通道,下調(diào)一過(guò)性外向型K+電流(Ito),醛固酮對(duì)于心室心肌細(xì)胞的延遲整流鉀電流是否具有調(diào)節(jié)作用尚不清楚。成年的豚鼠心室細(xì)胞缺乏Ito,IKr和IKs是其動(dòng)作電位復(fù)極的主要成份,我們前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高醛固酮血癥可以延長(zhǎng)豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位,提示醛固酮可能具有調(diào)控IKr和IKs的作用。為此,本研究目的就是主要利用電生理技術(shù)在高醛固酮整體動(dòng)物和體外培養(yǎng)細(xì)胞研究醛固酮對(duì)成年豚鼠心室肌細(xì)胞延遲整流K+電流IKr和IKs的影響,并分析其作用機(jī)制。第一部分高醛固酮血癥對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響目的:觀察在體試驗(yàn)中高醛固酮血癥對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、延遲整鉀電流的影響。方法:成年雄性豚鼠,200-250g,每組10只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,2.5%三溴乙醇腹腔注射(225mg·kg 1)麻醉下背部皮下植入滲透性微泵給予醛固酮泵入28天。醛固酮溶解在聚乙二醇400(PEG-400,釋放速度1μg·h 1)。對(duì)照組按相同方式植入微泵給予溶劑。各組豚鼠可以自由獲得含0.5%Na+的正常食物和水,同時(shí)被保持在一個(gè)恒定飼養(yǎng)環(huán)境中(傳統(tǒng)的12h/12h晝夜周期,6 am開(kāi)始)。給藥結(jié)束后,取豚鼠血液1.5-2 ml,測(cè)定血清K、Na離子濃度。之后取心臟,酶法急性分離豚鼠左室心肌細(xì)胞,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),分別記錄動(dòng)作電位、IKs、IKr,觀察醛固酮對(duì)心肌動(dòng)作電位和延遲整流鉀電流IKs、IKr的影響。采用電壓鉗進(jìn)行刺激和記錄。膜片鉗技術(shù)V-clamp模式記錄細(xì)胞膜電流,微電極拋光后,灌充電極內(nèi)液,控制電阻值在1-3M?。電極內(nèi)液成分為(m M):KCl 140,Mg-ATP 4,Mg Cl2 1,EGTA 5,and HEPES10(p H 7.2 with KOH);電極外液分為(m M):Na Cl 132,KCl 4,Ca Cl2 1.8,Mg Cl2 1.2,glucose 5 and HEPES 10(p H 7.4 with Na OH)。鉗制電壓在-40m V,使Na通道和T-型Ca通道失活;電極外液中加入尼莫地平(Nim,1μM),阻斷L-型Ca通道;記錄IKs時(shí)加入2mM E4031,阻斷延遲整流鉀電流快激活成分IKr;記錄IKr時(shí)加入20mM chromanol 293B,阻斷延遲整流鉀電流慢激活成分IKs。采用膜片鉗技術(shù)I-clamp模式:兩性霉素B(終濃度600ng/ml)加入電極內(nèi)液中,做穿孔膜片鉗記錄。在0.25Hz、0.5Hz、1Hz不同頻率下記錄豚鼠心室肌細(xì)胞膜動(dòng)作電位。電極內(nèi)液成分為(m M):谷氨酸鉀120,KCl 25,Mg Cl2 1,Ca Cl2 1,HEPES 10(p H 7.4 with KOH);電極外液分為(m M):Na Cl 138,KCl 4,Mg Cl2 1,Ca Cl2 2,Na H2PO4 0.33,glucose 10 and HEPES 10(p H 7.4 with Na OH)。通道激活的電流-電壓關(guān)系曲線用Boltzmann方程I/Imax=1/(1+exp[(Vt-V1/2)/k]擬合,其中V1/2為半數(shù)激活電壓。用Origin Pro 7.0,Adobe Illustrator 10,SPSS 19進(jìn)行圖象處理及數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SEM表示,兩組比較采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn),多組間比較采用ANOVA及Dunnett’s post hoc檢驗(yàn)。P0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果： 1對(duì)照組、醛固酮組、螺內(nèi)酯組、螺內(nèi)酯合用醛固酮組血清鉀濃度、血清鈉濃度均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。同樣,我們前期的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)這種方式制備高醛固酮血癥豚鼠模型不影響豚鼠血壓。2醛固酮長(zhǎng)期刺激延長(zhǎng)成年豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位。在不同刺激頻率下(0.25 Hz、0.5 Hz、1 Hz),醛固酮泵入組豚鼠左室心肌細(xì)胞APD90顯著延長(zhǎng)。3醛固酮長(zhǎng)期刺激下調(diào)豚鼠心肌細(xì)胞IKs,但是醛固酮沒(méi)有改變通道的電壓依賴活性,對(duì)照組與醛固酮組半數(shù)激活電壓分別是:37.4±2.8 m V、39.3±2.0 m V,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4醛固酮并不影響IKr電流密度,也沒(méi)有改變其電生理學(xué)特性。表明醛固酮對(duì)鉀通道的調(diào)節(jié)作用具有選擇性。結(jié)論:醛固酮長(zhǎng)期刺激下調(diào)成年豚鼠心室肌細(xì)胞IKs,延遲心肌細(xì)胞復(fù)極化,而且不依賴于血壓升高和電解質(zhì)的紊亂。醛固酮并不影響IKr,表明醛固酮對(duì)鉀通道的調(diào)節(jié)作用具有選擇性。第二部分醛固酮對(duì)體外培養(yǎng)成年豚鼠心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響目的:為了驗(yàn)證整體高醛固酮血癥模型下延遲整流鉀電流的變化,進(jìn)一步觀察醛固酮對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響。方法:嚴(yán)格無(wú)菌操作急性分離成年豚鼠心肌細(xì)胞后,心肌細(xì)胞逐級(jí)覆鈣(200,500,1000,and 1800μM)。靜置2h后去除死細(xì)胞。將醛固酮或DMSO溶劑分別加入新鮮培養(yǎng)基(Hyclone M199+Earle’s salts和L-glutamine)。細(xì)胞放入培養(yǎng)基后在37°C,5%CO2細(xì)胞孵育箱繼續(xù)孵育24小時(shí)。M199培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、2m M L-肉毒奸、5m M肌氨酸、100IU·ml-1青霉素、鏈霉素100μg·ml-1。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄培養(yǎng)豚鼠心肌細(xì)胞IKs、IKr,觀察醛固酮在體外對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響。結(jié)果： 1醛固酮孵育心肌細(xì)胞24小時(shí),下調(diào)心肌細(xì)胞IKs電流密度,此作用呈濃度依賴性。但醛固酮并不改變IKs通道的電壓依賴性的激活特性。2醛固酮(1μmol·L-1)孵育心肌細(xì)胞24小時(shí),不改變心肌細(xì)胞IKr電流密度,也不改變其電生理學(xué)特性。結(jié)論:與整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,在培養(yǎng)的成年豚鼠心肌細(xì)胞,醛固酮具有選擇性下調(diào)IKs電流密度的作用。第三部分醛固酮下調(diào)心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流慢激活成分的機(jī)制目的:利用整體動(dòng)物模型或體外培養(yǎng)細(xì)胞,探究醛固酮下調(diào)IKs的分子機(jī)制。方法:整體動(dòng)物給予醛固酮的方法同第一部分。為了評(píng)價(jià)醛固酮受體(MR)的中介作用,部分給予醛固酮的動(dòng)物同時(shí)給予MR拮抗劑螺內(nèi)酯(100 mg·kg 1·day 1)灌胃。給藥28天后,比較聯(lián)合應(yīng)用螺內(nèi)酯與單用醛固酮組心室肌細(xì)胞IKs之間的差別。體外培養(yǎng)成年豚鼠心室肌細(xì)胞的方法同第一部分。為進(jìn)一步明確鹽皮質(zhì)激素受體途徑、血管緊張素ⅡAT1途徑以及細(xì)胞內(nèi)鈣介導(dǎo)醛固酮對(duì)IKs的影響,用以下工具藥物與醛固酮共同孵育分離的心肌細(xì)胞24小時(shí):MR拮抗劑螺內(nèi)酯10μmol·L-1、熱休克蛋白HSP90抑制劑格爾德霉素1μmol·L-1、血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶抑制劑依那普利1μmol·L-1、AT1拮抗劑氯沙坦1μmol·L-1、L-型鈣通道阻斷劑尼莫地平1μmol·L-1、可膜通透性鈣離子螯合劑BAPTA-AM2.5μmol·L-1。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄培養(yǎng)豚鼠心肌細(xì)胞IKs,觀察這些工具要是否參與醛固酮對(duì)IKs的調(diào)節(jié)。成年豚鼠泵入醛固酮28天后或正常分離后的成年豚鼠心肌細(xì)胞經(jīng)醛固酮孵育24h,Trizol法提取心肌細(xì)胞總RNA,明確醛固酮對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞鉀通道KCNQ1、KCNE1以及ERG m RNA水平的影響。同時(shí)提取膜蛋白或全蛋白,做Westernblot分析,明確醛固酮對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞上述鉀通道蛋白合成水平的影響。結(jié)果： 1不管是在體實(shí)驗(yàn),還是離體實(shí)驗(yàn),鹽皮質(zhì)激素受體(MR)拮抗劑螺內(nèi)酯可以完全防止醛固酮引起的心肌細(xì)胞下調(diào)IKs的作用。HSP90抑制劑格爾德霉素、血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶抑制劑依那普利、AT1拮抗劑氯沙坦等分別與醛固酮共同孵育分離的心肌細(xì)胞24h后,可以逆轉(zhuǎn)醛固酮下調(diào)心肌細(xì)胞IKs。2鈣通道拮抗劑尼莫地平、鈣螯合劑BAPTA-AM等分別與醛固酮共同孵育分離的心肌細(xì)胞24h后,不能逆轉(zhuǎn)醛固酮下調(diào)心肌細(xì)胞IKs,而且尼莫地平、BAPTA-AM本身下調(diào)心肌細(xì)胞IKs。3成年豚鼠泵入醛固酮28天后,醛固酮抑制心肌細(xì)胞KCNQ1、KCNE1 m RNA轉(zhuǎn)錄及KCNQ1、KCNE1蛋白合成;而醛固酮不影響ERG m RNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成。4正常分離后的成年豚鼠心肌細(xì)胞與醛固酮孵育24h,醛固酮抑制心肌細(xì)胞KCNQ1、KCNE1蛋白合成及KCNQ1、KCNE1m RNA轉(zhuǎn)錄,而醛固酮不影響ERG m RNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成。結(jié)論:醛固酮通過(guò)經(jīng)典受體途徑,抑制心肌細(xì)胞KCNQ1、KCNE1m RNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成,下調(diào)心肌細(xì)胞IKs。醛固酮作用于心肌MR下調(diào)IKs過(guò)程中,MR受體與血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生以及AT1之間可能存在相互作用。但是醛固酮下調(diào)IKs并不是繼發(fā)于醛固酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)調(diào)節(jié)及內(nèi)向型L-型鈣電流的增加。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
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本文編號(hào)：1702564