本文選題：過(guò)敏性氣道炎　切入點(diǎn)：羧胺三唑　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景哮喘是一種慢性氣道炎癥,涉及多種炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)。近年來(lái)隨著空氣污染加重,哮喘的發(fā)病率亦呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物是目前治療該疾病的最有效藥物,但少數(shù)患者對(duì)糖皮質(zhì)激素存在抵抗,治療效果不理想,且長(zhǎng)時(shí)間使用糖皮質(zhì)激素還會(huì)產(chǎn)生一定的耐藥性及藥物依賴(lài)性。因此,我們亟需尋找有效的替代方法來(lái)預(yù)防和治療這種氣道炎性疾病[1-2]。狻胺三唑(Carboxyamidotriazole,CAI)是一種非細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物,為人工合成小分子化合物。能夠抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流,早期表現(xiàn)出良好的抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用。近幾年,本課題組通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),CAI還具有良好的抗炎作用,對(duì)急、慢性炎癥均有良好的抑制作用[3-4]。且本課題組研究發(fā)現(xiàn),CAI是一種非選擇性的磷酸二酯酶(PDE)抑制劑,通過(guò)非選擇性地抑制各亞型PDEs,抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎作用。在PDEs家族中,PDE4主要表達(dá)于炎癥細(xì)胞、平滑肌、大腦等組織中,與炎癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系[5]。綜上,我們提出假設(shè):羧胺三唑(CAI)能否在過(guò)敏性氣道炎中起到較好的治療作用,且是否是通過(guò)抑制PDE4的表達(dá)發(fā)揮作用的;若以上假設(shè)成立,如何將CAI的抗炎效果與現(xiàn)有的藥物結(jié)合,使治療效果發(fā)揮最佳。研究方法1.羧胺三唑?qū)Υ笫蠓闻菥奘杉?xì)胞(NR8383)分泌炎癥因子的影響及潛在靶點(diǎn)的研究實(shí)驗(yàn)分為正常組(CON)、激發(fā)組(LPS)、20μMCAI低劑量治療組(CAI20)、40μM CAI高劑量治療組(CAI40)、地塞米松陽(yáng)性藥對(duì)照組(DEX)。使用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)激發(fā)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383),分別檢測(cè)激發(fā)后24h及48h細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)NR8383細(xì)胞中PDE-4B表達(dá)水平。2.羧胺三唑?qū)π∈筮^(guò)敏性氣道炎癥的治療作用及潛在靶點(diǎn)的研究使用OVA誘導(dǎo)致敏激發(fā)的方法建立OVA過(guò)敏性氣道炎癥模型,模型建立周期為28天。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組(CON)、模型組(OVA)、20mg/kg CAI低劑量治療組(CAI20)、40mg/kgCAI高劑量治療組(CAI40)、地塞米松陽(yáng)性藥對(duì)照組(DEX)。使用肺功能儀檢測(cè)氣道高反應(yīng)性;取肺泡灌洗液(BALF),酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)其中IL-4、IL-13、IFN-γ水平;細(xì)胞計(jì)數(shù)及瑞氏-吉姆薩染色檢測(cè)BALF中總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù);心臟取血得到血清,ELISA法檢測(cè)血清中IgE水平;取左肺固定后,進(jìn)行肺組織切片,HE染色后觀察肺組織病理水平改變,PAS染色后觀察氣道黏液分泌情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)肺組織中PDE-4A、PDE-4B 及 PDE-4D 表達(dá)水平。3.羧胺三唑聯(lián)合地塞米松對(duì)小鼠過(guò)敏性氣道炎癥的治療作用實(shí)驗(yàn)分為正常組(CON)、模型組(OVA)、40mg/kgCAI治療組(CAI40)、0.25mg/kg低劑量地塞米松治療組(DL)、0.5mg/kg高劑量地塞米松治療組(DH)、0.25mg/kg低劑量地塞米松聯(lián)合20mg/kgCAI治療組(DL20)、0.25mg/kg低劑量地塞米松聯(lián)合40mg/kgCAI治療組(DL40)。建立過(guò)敏性哮喘模型,取BALF,ELISA法檢測(cè)其中IL-4、IL-13、IFN-γ水平;細(xì)胞計(jì)數(shù)及瑞氏-吉姆薩染色檢測(cè)BALF中總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù);心臟取血得到血清,ELISA法檢測(cè)血清中IgE水平;取左肺固定后,進(jìn)行肺組織切片,HE染色后觀察肺組織病理水平改變。研究結(jié)果1.羧胺三唑?qū)Υ笫蠓闻菥奘杉?xì)胞(NR8383)分泌炎癥因子的影響及潛在靶點(diǎn)的研究1.1.1μg/ml的LPS能夠成功誘導(dǎo)NR8383分泌致炎因子(P0.01)。1.2.給藥24h后收樣,發(fā)現(xiàn)與正常組相比,LPS誘導(dǎo)組分泌IL-1β量顯著增加(P0.01)。與誘導(dǎo)組相比,CAI20組細(xì)胞IL-1β分泌量顯著降低(P0.05),CAI40組與DEX組細(xì)胞IL-1β分泌量顯著降低(P0.01)。1.3.給藥24h和48h后,LPS誘導(dǎo)組分泌IL-6和TNF-α量顯著增加(P0.001),與誘導(dǎo)組相比,治療組分泌IL-6和TNF-α量均顯著下降(P0.001)。1.4.與正常組相比,LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞中PDE-4B的mRNA表達(dá)量顯著增加(P0.001)。與誘導(dǎo)組相比,CAI治療組細(xì)胞中PDE-4B的mRNA表達(dá)量均顯著下降(P0.001),說(shuō)明CAI是PDE-4B的抑制劑。2.羧胺三唑?qū)π∈筮^(guò)敏性氣道炎癥的治療作用及潛在靶點(diǎn)的研究2.1.卵清蛋白致敏激發(fā)的方法可以成功地建立小鼠過(guò)敏性氣道炎癥模型,主要表現(xiàn)為小鼠氣道高反應(yīng)性變化明顯,炎癥細(xì)胞分化聚集,致炎因子分泌增多,支氣管平滑肌增厚,肺組織病理結(jié)構(gòu)明顯變化等。2.2.使用肺功能儀檢測(cè)小鼠氣道高反應(yīng)性變化時(shí),給予20mg/ml濃度的乙酰膽堿溶液刺激時(shí),與正常組小鼠相比,模型組小鼠氣道阻力顯著升高(P0.001),氣道動(dòng)態(tài)順應(yīng)性顯著降低(P0.01)。與模型組小鼠相比,CAI40組小鼠的氣道阻力變化顯著回落(P0.01),氣道動(dòng)態(tài)順應(yīng)性顯著回升(P0.05),CAI20組小鼠的氣道阻力也有所下降,氣道動(dòng)態(tài)順應(yīng)性也有所回升,但與模型組小鼠相比無(wú)明顯差異。2.3.計(jì)算肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例結(jié)果顯示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠BALF中總炎癥細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P0.001)。與模型組小鼠相比,CAI40組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)下降顯著(P0.01),嗜酸性粒細(xì)胞比例也顯著下降(P0.001)。而與模型組小鼠相比,CAI20組小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯下降(P0.01)。2.4.ELISA檢測(cè)小鼠肺泡灌洗IL-4、IL-13水平,與正常組小鼠相比,模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13含量顯著增加(P0.001),CAI20組會(huì)顯著降低BALF中IL-4的含量(P0.01),CAI40組會(huì)也顯著降低BALF中IL-4及 IL-13 含量(P0.01)。2.5.ELISA檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量發(fā)現(xiàn),與正常組小鼠相比,模型組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量顯著降低(P0.001),而CAI40組可顯著緩解IFN-γ含量的下降(P0.001)。2.6.ELISA檢測(cè)小鼠血清中總IgE含量及OVA特異型IgE含量發(fā)現(xiàn),與正常組小鼠相比,模型組小鼠血清中兩種IgE含量均明顯上升(P0.001),說(shuō)明該模型是一個(gè)很?chē)?yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。而與模型組小鼠相比,CAI40組可明顯降低兩種IgE含量(P0.01)。2.7.通過(guò)肺組織HE染色發(fā)現(xiàn),與正常組小鼠相比,模型組小鼠的支氣管壁上皮明顯增厚、脫落,支氣管平滑肌增厚,杯狀細(xì)胞增生明顯,病理評(píng)分指數(shù)顯著升高(P0.001)。與模型組小鼠相比,CAI20組小鼠的氣道重塑現(xiàn)象有所緩解(P0.01),但不十分明顯。而CAI40組及DEX組小鼠的氣道重塑現(xiàn)象明顯緩解,兩組小鼠均未見(jiàn)明顯的氣道上皮及平滑肌增厚,亦未見(jiàn)明顯的杯狀細(xì)胞增生,氣道周?chē)装Y細(xì)胞分泌聚集明顯減少,病理評(píng)分指數(shù)亦顯著下降(P0.001)。2.8.通過(guò)PAS染色發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組小鼠肺泡中黏液分泌明顯增多,而CAI40組及DEX組小鼠肺泡中黏液分泌顯著減少。2.9.通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)小鼠肺組織PDE4各亞型表達(dá)量發(fā)現(xiàn),與正常組小鼠相比,模型組小鼠肺組織中PDE-4A和PDE-4D表達(dá)量顯著增加(P0.05),而與模型組相比,CAI40組小鼠肺組織中PDE-4A和PDE-4D表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.05)。與正常組小鼠相比,模型組小鼠肺組織中PDE-4B的表達(dá)量顯著增加(P0.001),而CAI20組和CAI40組小鼠肺組織中PDE-4B的表達(dá)量均明顯下調(diào)(P0.05)。由此可見(jiàn)CAI是PDE4的抑制劑。3.羧胺三唑聯(lián)合地塞米松對(duì)小鼠過(guò)敏性氣道炎癥的治療作用3.1.ELISA檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13水平發(fā)現(xiàn),與模型組相比,合用組(DL20組、DL40組)均可顯著降低升高的小鼠BALF中IL-4、IL-13含量(P0.001),而且DL20組的治療效果要優(yōu)于DL40組。3.2.ELISA檢測(cè)小鼠肺泡灌洗中IFN-γ的含量發(fā)現(xiàn),與模型組相比,合用組(DL20組、DL40組)均可使下降的IFN-γ的含量顯著回升(P0.05),且DL40組的治療效果要優(yōu)于DL20組。3.3.將小鼠BALF中IL-4的含量與IFN-γ的含量作比,可得到Th2細(xì)胞與Th1細(xì)胞功能的失衡比,我們發(fā)現(xiàn),與正常組小鼠相比,模型組小鼠Th2/Th1細(xì)胞功能?chē)?yán)重失衡(P0.001),而兩組合用組均可顯著降低失衡比的指數(shù)(P0.001),其總體來(lái)說(shuō),DL20組的治療效果優(yōu)于DL40組。3.4.計(jì)算肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例結(jié)果顯示,兩個(gè)聯(lián)合用藥組均可顯著下調(diào)過(guò)度分泌的炎癥細(xì)胞且降低嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥細(xì)胞中的比例(P0.01),在控制炎癥細(xì)胞過(guò)分泌方面,DL40組的效果略優(yōu)于DL20組。3.5.ELISA檢測(cè)小鼠血清中IgE含量發(fā)現(xiàn),兩個(gè)聯(lián)合用藥組均可顯著下調(diào)由過(guò)敏性反應(yīng)引起的小鼠血清中IgE含量升高(P0.01),使過(guò)敏性炎癥得到顯著緩解,且DL40組對(duì)血清中IgE含量下調(diào)效果優(yōu)于DL20組。3.6.通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn),與正常組小鼠相比,模型組小鼠的支氣管壁上皮明顯增厚、脫落,支氣管平滑肌增厚,杯狀細(xì)胞增生明顯,氣道周?chē)梢?jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞聚集浸潤(rùn),病理評(píng)分指數(shù)顯著升高(P0.001)。單獨(dú)用藥組對(duì)小鼠氣道重塑均有抑制作用,病理評(píng)分指數(shù)顯著下降(P0.001)。兩個(gè)聯(lián)合用藥組小鼠抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的作用均強(qiáng)于三個(gè)單獨(dú)用藥組,均未見(jiàn)明顯的氣道上皮及平滑肌增厚,亦未見(jiàn)明顯杯狀細(xì)胞增生,病理評(píng)分指數(shù)顯著下降(P0.001)。結(jié)論在大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383的實(shí)驗(yàn)中,CAI可以顯著緩解由LPS誘導(dǎo)的炎癥因子分泌,且可以有效抑制NR8383中PDE-4B的表達(dá)。在小鼠過(guò)敏性氣道炎的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)CAI可以有效緩解小鼠的氣道高反應(yīng)性,降低炎癥因子分泌,緩解炎癥細(xì)胞的聚集,降低血液中IgE的含量,緩解過(guò)敏現(xiàn)象。小鼠的氣道重塑現(xiàn)象得到明顯緩解,CAI會(huì)抑制平滑肌增厚,抑制杯狀細(xì)胞增生,減少氣道周?chē)装Y細(xì)胞分泌聚集。且CAI可以有效抑制小鼠肺組織中PDE-4A、PDE-4B及PDE-4D的表達(dá),是PDE4抑制劑。在聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),兩個(gè)聯(lián)合用藥組均有良好的治療效果,均比單獨(dú)使用同等劑量的藥物治療效果明顯,且使用低劑量地塞米松搭配低劑量的CAI表現(xiàn)出的治療效果與單獨(dú)使用高劑量地塞米松效果相當(dāng)。在某些方面,DL20組的抗炎效果要優(yōu)于DL40組。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R965

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 姚力夫;陳虹;高穎;魏仔龍;楊慶利;;不同致敏方法對(duì)小鼠哮喘模型建立的影響[J];武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2016年02期

2 李靈君;韓尚河;陳國(guó)良;;磷酸二酯酶-4抑制劑的研究進(jìn)展[J];沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2013年07期

，

本文編號(hào)：1701084