本文選題：殼聚糖　切入點(diǎn)：羧甲基殼聚糖　出處：《中國海洋大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：化學(xué)治療是抑制惡性腫瘤最常用也是最有效的治療方式。目前，大多數(shù)用于化學(xué)治療的抗癌藥物一般采用靜脈滴注的給藥方式。靜脈滴注的給藥方式雖然直接有效，但同時也具有耗時長，副作用大，無法連續(xù)治療的缺點(diǎn)�？诜拱┧幬锵鄬κ┧幏奖�，耗時短，病患依從度高，但胃腸道和肝臟的首過效應(yīng)使得口服化學(xué)療法難以實(shí)現(xiàn)。殼聚糖(Chitosan, CS)作為一種天然的陽離子多糖，具有良好的生物相容性和組織親和性，它能夠可逆性的打開小腸上皮細(xì)胞間緊密連接，使藥物通過細(xì)胞旁途徑進(jìn)入人體循環(huán)，在口服藥物輸送領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。 對CS進(jìn)行羧甲基化修飾，制備出中性條件下可溶的羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl chitosan, CMCS）,紅外光譜檢測證實(shí)了羧甲基基團(tuán)成功連接在殼聚糖分子骨架上，烏氏粘度法測定CMCS的分子量為12kDa，元素分析結(jié)果表明CMCS的脫乙酰度和羧甲基取代度分別為81%和92%。分別以3H-吲哚菁型生物熒光標(biāo)示染料（Cy3NHS Ester）和異硫氰酸熒光素（FITC）為熒光標(biāo)記，共價連接在CS和CMCS主鏈上（Cy3-CS，F(xiàn)ITC-CMCS）,用于對載體材料定位示蹤。 以離子交聯(lián)法制備CS納米凝膠（CS-nanogels，CS-NGs），平均粒徑和zeta電位分別為187.8nm和+33.4mV，以聚電解質(zhì)凝聚法合成了CS/CMCS納米凝膠（CS/CMCS-nanogels, CS/CMCS-NGs），平均粒徑和zeta電位分別為202.4nm和-40.7mV。透射電鏡觀察CS-NGs和CS/CMCS-NGs均為球形，其中CS/CMCS-NGs形狀規(guī)則，粒徑大小均一，分散均勻，而離子交聯(lián)法制得的CS-NGs為不規(guī)則球形，粒徑分布較寬，并有團(tuán)聚現(xiàn)象出現(xiàn)。溶血實(shí)驗(yàn)表明，CS-NGs和CS/CMCS-NGs的紅細(xì)胞溶血率均低于5%，符合醫(yī)用材料對于溶血率的要求。蛋白吸附實(shí)驗(yàn)表明，CS-NGs和CS/CMCS-NGs對牛血清蛋白（Bovine serumalbumin， BSA）的非特異性吸附率較低，結(jié)合溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種納米凝膠有較好的血液相容性。采用MTT法檢測了CS-NGs和CS/CMCS-NGs的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明兩種納米凝膠對胎鼠成纖維細(xì)胞（MEFs）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）具有良好的細(xì)胞相容性，當(dāng)濃度為1000μg/mL時，對人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）表現(xiàn)出潛在的細(xì)胞毒性。 以鹽酸阿霉素（Doxorubicin hydrochloride，DOX）為模型藥物，通過離子交聯(lián)/聚電解質(zhì)凝聚法結(jié)合透析的方法制備了包載DOX的殼聚糖納米凝膠（DOX:CS-NGs）和包載DOX的殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米凝膠（DOX:CS/CMCS-NGs），其平均粒徑分別為209.6nm和279.3nm；zeta電位分別為32.8mv和-33.8mv；DOX包封率分別為35.43%和72.87%；DOX包載量分別為14.9%和21.4%。利用透析法研究DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs在連續(xù)的胃腸道模擬液中的釋藥行為，結(jié)果表明，在胃模擬液（pH1.2）中，DOX:CS-NGs的藥物釋放速率明顯高于DOX:CS/CMCS-NGs，2h內(nèi)，DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的藥物累積釋放率分別為32.4%和12.6%；隨著釋藥介質(zhì)依次改變?yōu)槭改c模擬液（pH6.0，2h），空腸模擬液（pH7.0，2h），DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的藥物釋放速率較慢且大致相同，二者的藥物累計釋放率分別為，十二指腸模擬液：DOX:CS-NGs42.3%，DOX:CS/CMCS-NGs22.4%；空腸模擬液： DOX:CS-NGs61.2%，DOX:CS/CMCS-NGs38.7%，當(dāng)釋藥介質(zhì)改變?yōu)榛啬c/小腸上皮細(xì)胞間隙模擬液（pH7.4，2h）后，DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的釋藥速率加快，其終點(diǎn)藥物累計釋藥率為87.6%和81.4%。以上結(jié)果表明，與DOX:CS-NGs相比，DOX:CS/CMCS-NGs能夠有效降低藥物在胃酸環(huán)境下的突釋，將藥物定向輸送至小腸部位,在進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞間隙后釋放藥物。以小腸囊法分別研究了DOX:CS/CMCS-NGs和DOX:CS-NGs在大鼠不同腸段中的粘膜粘附性及通透，結(jié)果表明，DOX:CS/CMCS-NGs在十二指腸、空腸以及回腸部位能夠有效促進(jìn)相應(yīng)腸段對DOX的粘附及吸收，其藥物透過率和粘附率分別為DOX:CS-NGs的1-3.2倍和1.1 2.4倍。 以傳統(tǒng)靜脈注射DOX作為對照，分別對小鼠進(jìn)行口服DOX溶液、DOX:CS-NGs以及DOX:CS/CMCS-NGs，研究了四種劑型的藥代動力學(xué)和組織分布，結(jié)果表明，DOX:CS/CMCS-NGs能夠有效提高DOX的口服生物利用度，其絕對生物利用度為42%，是口服的6倍DOX，口服DOX:CS-NGs的1.75倍�？诜﨑OX:CS/CMCS-NGs24h后，在小鼠的肝臟、脾臟、肺部仍可檢測到DOX，且含量遠(yuǎn)高于其他三種劑型，表明DOX:CS/CMCS-NGs能夠顯著延長DOX在體內(nèi)的循環(huán)時間。以小鼠為動物模型，通過分別在1d和15d兩次給藥的方式，研究了25天內(nèi)靜脈注射DOX、口服空白CS/CMCS-NGs以及口服DOX:CS/CMCS-NGs的對小鼠的心腎臟毒性，測量小鼠的體重以及心腎重量和生化指標(biāo)，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)靜脈注射DOX相比，口服DOX:CS/CMCS-NGs能夠顯著減小DOX的心腎毒性。 利用Caco-2細(xì)胞對雙熒光納米凝膠（Cy3-CS/FITC-CMCS-NGs）的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的方式和途徑進(jìn)行了定性和定量研究，結(jié)果表明，Caco-2細(xì)胞對Cy3-CS/FITC-CMCS-NGs的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)主要是一種主動運(yùn)輸，主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)行。分別研究了CS、CMCS以及CS/CMCS-NGs在不同pH值環(huán)境下對鈣離子的螯合作用，結(jié)果表明，三種材料對鈣離子的螯合能力隨pH值的升高而加強(qiáng)，其對鈣離子的螯合能力為CS/CMCS-NGs＞CMCS＞CS，表明CS/CMCS-NGs對鈣離子具有的較高的螯合能力主要?dú)w因于納米凝膠的3D結(jié)構(gòu)中和CMCS組分。利用Caco-2致密單層構(gòu)建小腸吸收模型，研究了DOX:CS/CMCS-NGs經(jīng)細(xì)胞旁途徑透粘膜的機(jī)理，結(jié)果表明，納米凝膠的CS和CMCS組分均能夠可逆性降低Caco-2致密單層的跨膜電阻（Transepithelialelectrical resistance, TEER），使藥物經(jīng)腸道通過細(xì)胞旁途徑進(jìn)入體循環(huán)，其中，CS降低TEER的幅度隨pH的升高（pH6.6-pH7.4）而減小，而CMCS降低TEER的幅度隨pH值的升高（pH6.6-pH7.4）而增大。向DOX:CS/CMCS-NGs中加入鈣離子后，Caco-2的TEER的降低幅度顯著減小，結(jié)合納米凝膠及其組分對鈣離子的螯合作用表明，DOX:CS/CMCS-NGs經(jīng)細(xì)胞旁途徑透粘膜作用歸因于其CS和CMCS組分的協(xié)同作用，在弱酸性（pH＜7）條件下，，即十二指腸環(huán)境中，DOX:CS/CMCS-NGs中質(zhì)子化的CS組分能夠打開細(xì)胞間緊密連接，同時，部分去質(zhì)子化的CMCS組分能夠螯合鈣離子，打開細(xì)胞間粘合連接進(jìn)而促進(jìn)藥物通過細(xì)胞旁途徑進(jìn)入體循環(huán)；在中性及弱堿性條件（pH≥7）下，即空腸和回腸環(huán)境中，CS組分去質(zhì)子化，打開細(xì)胞間緊密連接的能力減弱，而完全去質(zhì)子化的CMCS組分螯合鈣離子能力增強(qiáng)，確保藥物的持續(xù)吸收。 采用離子交聯(lián)結(jié)合滴注法和乳化法的方式以將DOX:CS/CMCS-NGs固定于多層海藻酸鈣膠球（Multilayer alginate bead, M-ALG-Bead）中，得到載藥納米凝膠固定化多層球（NGs-M-ALG-Bead）,利用響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化制備過程，結(jié)果表明，NGs-M-ALG-Bead對DOX的包封率與海藻酸鈉的濃度、氯化鈣濃度以及DOX:CS/CMCS-NGs濃度有關(guān)而與多層球的層數(shù)無關(guān)，當(dāng)海藻酸鈉的濃度為3.44%，氯化鈣濃度為3.23%，DOX:CS/CMCS-NGs濃度為0.3%時，得到最高的藥物包封率（97.21%）。不同層數(shù)的NGs-M-ALG-Bead的溶脹實(shí)驗(yàn)及NGs-M-ALG-Bead在連續(xù)胃腸道模擬液中的釋藥動力學(xué)表明，4層的NGs-M-ALG-Beads在胃酸環(huán)境下最穩(wěn)定，其溶脹率和藥物累計釋放率分別5%和3.8%，有利于提高劑型在小腸部位處的有效濃度，而在小腸部位，隨著海藻酸鈉多層球的解體，完整的DOX:CS/CMCS-NGs被逐漸釋放出來，有利于延長DOX:CS/CMCS-NGs與小腸上皮粘膜的接觸時間，提高小腸對藥物的吸收效果，離體小腸粘附性和通透性實(shí)驗(yàn)表明，NGs-M-ALG-Beads能夠有效提高DOX:CS/CMCS-NGs的粘膜粘附率和藥物通透率，分別為游離DOX:CS/CMCS-NGs的1.07-1.15倍和1.28-1.38倍。 本文以殼聚糖及其水溶性衍生物羧甲基殼聚糖為原料，制備了一種殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米凝膠用于口服藥物的輸送。通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估了該材料的粘膜粘附性、通透性以及生物安全性并研究了其透粘膜機(jī)理。通過將該納米凝膠固定于海藻酸鈣多層球中，進(jìn)一步提高了藥物的輸送效率，結(jié)果證明該納米凝膠有望成為一種安全有效的藥物口服輸送載體。
[Abstract]:Chitosan ( CS ) is a kind of natural cationic polysaccharide , has good biocompatibility and tissue affinity , and has good biocompatibility and tissue affinity .

Carboxymethyl chitosan ( CMCS ) was prepared by carboxymethylation modification of CS . The molecular weight of CMCS was determined to be 12 kDa . The molecular weight of CMCS was 12 kDa . The results showed that the degree of deacetyl and carboxymethyl substitution of CMCS were 81 % and 92 % , respectively .

CS / CMCS - nanogels , CS / CMCS - NGs , CS / CMCS - NGs , CS / CMCS - NGs , CS / CMCS - NGs , CS / CMCS - NGs , CS / CMCS - NGs , CS / CMCS - NGs , CS / CMCS - NGs , CS - NGs and CS / CMCS - NGs were observed .

Chitosan / carboxymethyl chitosan ( CS / CMCS - NGs ) was prepared by ion - crosslinking / polyelectrolyte coagulation combined with chitosan / carboxymethyl chitosan ( CS / CMCS - NGs ) . The average particle size of chitosan / CMCS - NGs was 209.6 nm and 279.3 nm , respectively .
the zeta potential is 32.8mv and - 33.8mv , respectively ;
The encapsulation efficiency was 35.43 % and 72.87 % , respectively .
The drug release rate of CS / CMCS - NGs and CS / CMCS - NGs was significantly higher than that in CS / CMCS - NGs , 2h . The drug release rate of CS - NGs and CS / CMCS - NGs was 32.4 % and 12.6 % , respectively .
The drug release rate of CS / CMCS - NGs was slower and almost the same . The drug release rate of CS / CMCS - NGs was slower and approximately the same with that of CS / CMCS - NGs .
絀鴻偁妯℃嫙娑詫細(xì) DOX:CS-NGs61.2%,DOX:CS/CMCS-NGs38.7%,褰撻噴鑽粙璐ㄦ敼鍙樹負(fù)鍥炶偁/灝忚偁涓婄毊緇嗚優(yōu)闂撮殭妯℃嫙娑

本文編號：1689413