本文選題：鼠傷寒沙門氏菌　切入點(diǎn)：群體感應(yīng)系統(tǒng)　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的 耐藥細(xì)菌感染是臨床抗感染治療中極為棘手的問題，也是造成重癥感染死亡的首要原因，已成為各國政府高度關(guān)注的社會(huì)公共健康問題。目前，抗生素仍是臨床治療細(xì)菌感染性疾病的一線藥物。然而，幾乎所有抗生素在應(yīng)用過程中都會(huì)不可避免地誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥。因此，新型抗生素的研制并不能從根本上解決細(xì)菌耐藥問題，尋找和研制不誘導(dǎo)耐藥的新型抗菌藥物成為當(dāng)今抗菌藥物研發(fā)領(lǐng)域的最新熱點(diǎn)，代表著未來新型抗菌藥物研發(fā)的新方向。 群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing system, QSS）是廣泛存在于細(xì)菌內(nèi)的一種群體行為調(diào)控系統(tǒng)，其中QseC是廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中的QSS，它參與調(diào)控多種致病毒力基因的表達(dá)，與革蘭氏陰性菌毒力、侵襲力和致病性密切相關(guān)。業(yè)已證實(shí)，抑制細(xì)菌QseC可以顯著抑制多種毒力因子的表達(dá)，降低細(xì)菌的致病性，但不影響細(xì)菌的生長，因而不會(huì)對細(xì)菌生長造成選擇性壓力，具有不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。因此，以QseC為靶點(diǎn)的不易誘導(dǎo)耐藥的新型抗菌藥物已成為研究的新趨勢和新熱點(diǎn)。然而，目前已知所有作用于QseC的抑制劑在體外均無抑菌或殺菌作用，僅在感染動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出抗菌作用。迄今為止，這一現(xiàn)象的內(nèi)在規(guī)律和機(jī)制幾乎完全不清楚。本研究旨在探討QseC抑制劑體內(nèi)抗菌作用可能的機(jī)理，為深入認(rèn)識QseC抑制劑的體內(nèi)抗菌規(guī)律提供重要的研究線索，為通過抑制細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的抗菌策略探索新路徑。 方法 1. QseC選擇性抑制劑Br-LED209的合成與表征：以對乙酰胺基苯磺酰氯和對溴苯胺為起始反應(yīng)物，分別通過�；磻�(yīng)和去酰化反應(yīng)脫保護(hù)得到4-氨基-N-(4-溴苯基)苯磺酰胺，最后與異硫氰酸苯酯硫脲化得到N-(4-溴苯基)-4-(3-苯基硫脲基)苯磺酰胺，即Br-LED209，產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜（MS）、核磁共振氫譜（1H NMR）和核磁共振碳譜（13C NMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 2. Br-LED209對體外培養(yǎng)細(xì)菌生長的影響：使用微量稀釋法測定Br-LED209對鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、腸出血性大腸埃希菌（enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）、福氏志賀菌（Shigella flexneri）的最低抑菌濃度（MIC）。使用全自動(dòng)生長曲線分析儀定時(shí)測定細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光度（OD600），，觀察Br-LED209在10μM、50μM和200μM濃度范圍內(nèi)對細(xì)菌生長的影響，以左氧氟沙星作為陽性對照藥，繪制細(xì)菌生長曲線。 3. Br-LED209在鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠體內(nèi)抗菌作用：BALB/c小鼠腹腔注射約1.0×108CFU鼠傷寒沙門氏菌，制備小鼠膿毒癥模型。于感染前、感染后3小時(shí)分別灌胃給予Br-LED20920mg/kg，感染后24小時(shí)，脫頸處死小鼠，獲取肝臟、脾臟、肺臟和腎臟進(jìn)行勻漿，勻漿液10倍梯度稀釋后均勻涂布于瓊脂平板，計(jì)數(shù)感染小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腎臟細(xì)菌CFU，評價(jià)Br-LED209對感染小鼠臟器荷菌量的影響。制備感染小鼠肝臟、脾臟病理切片，進(jìn)行HE染色，評價(jià)Br-LED209對感染小鼠臟器的保護(hù)作用。 4. Br-LED209對鼠傷寒沙門氏菌毒力基因表達(dá)影響：鼠傷寒沙門氏菌在200μΜ Br-LED209作用下培養(yǎng)12小時(shí)后，吸取各組菌液1mL加入1.5mLEP管中，4°C，12000rpm離心2分鐘收集菌體沉淀。按照天根試劑盒說明書操作提取細(xì)菌總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測Br-LED209對受QseC群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的下游重要致病毒力因子flhDC、sifA和sopB基因表達(dá)的影響，確證Br-LED209是否能阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC群體感應(yīng)系統(tǒng)。 5. Br-LED209抗菌作用機(jī)理的初步探討：將鼠傷寒沙門氏菌穿刺接種于含0.3%瓊脂粉的半固體LB培養(yǎng)基，37°C孵育16小時(shí)后，測量細(xì)菌生長擴(kuò)散環(huán)直徑，評價(jià)Br-LED209對其鞭毛動(dòng)力的影響。用鼠傷寒沙門氏菌感染HeLa細(xì)胞，感染后1、6、12小時(shí)裂解細(xì)胞，裂解液梯度稀釋后涂布瓊脂平板計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU，評價(jià)Br-LED209對鼠傷寒沙門氏菌上皮細(xì)胞侵襲力及細(xì)胞內(nèi)增殖力的影響。用鼠傷寒沙門氏菌感染腹腔巨噬細(xì)胞，1小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清，檢測上清中乳酸脫氫酶（LDH）釋放量，并拍照記錄感染后巨噬細(xì)胞形態(tài)，評價(jià)Br-LED209對鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡（pyroptosis）的影響；采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和碘化丙啶（PI）對感染巨噬細(xì)胞進(jìn)行組合染色，熒光顯微鏡下觀察PI陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算PI陽性細(xì)胞百分率，評價(jià)Br-LED209對鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞焦亡率的影響。鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞，1小時(shí)后提取上清蛋白，western blotting蛋白印跡法檢測巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平，評價(jià)Br-LED209對感染后巨噬細(xì)胞炎性復(fù)合體功能的影響。鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，裂解細(xì)胞，裂解液梯度稀釋后涂布瓊脂平板計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU，評價(jià)Br-LED209對巨噬細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌存活率的影響。 結(jié)果 1.合成結(jié)構(gòu)正確的QseC選擇性抑制劑Br-LED209：合成的Br-LED209為淡黃色固體，熔點(diǎn)116~120°C，質(zhì)譜測得其分子量為460.16，與理論值460.99基本相符，核磁共振氫譜和碳譜結(jié)果顯示各歸屬與目標(biāo)產(chǎn)物一致，純度大于95%，表明合成產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)匹配無誤，可以用于下一步研究。 2. Br-LED209不影響體外培養(yǎng)細(xì)菌的生長：MIC測定結(jié)果顯示，Br-LED209在256μg/mL濃度時(shí)未顯示出明顯抑制鼠傷寒沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌和福氏志賀菌的作用；細(xì)菌生長曲線的結(jié)果顯示，Br-LED209在10~200μM濃度范圍內(nèi)對細(xì)菌生長無影響。上述結(jié)果確證，Br-LED209在體外無明顯抑菌作用。 3. Br-LED209顯著減少鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠臟器荷菌量：鼠傷寒沙門氏菌感染BALB/c小鼠，于感染前、感染后3小時(shí)，分別灌胃給予Br-LED20920mg/kg，感染后24小時(shí)取肝臟、脾臟、肺臟和腎臟標(biāo)本檢測臟器內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果顯示，空白對照組小鼠肝臟、脾臟、肺臟、腎臟內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量分別為6.03×107CFU、1.04×108CFU、1.02×106CFU和8.02×105CFU，感染小鼠經(jīng)Br-LED209處理后，其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量分別減少至1.01×107CFU、2.06×107CFU、1.68×105CFU和1.33×105CFU，與對照組相比有顯著差異（P0.001）。同時(shí)，Br-LED209處理后能減輕感染小鼠肝臟、脾臟的病理損傷。上述結(jié)果提示，Br-LED209處理能夠降低細(xì)菌致病毒力，抑制細(xì)菌在感染小鼠體內(nèi)的存活和增殖能力。我們推測Br-LED209上述作用可能與其降低細(xì)菌毒力，啟動(dòng)機(jī)體天然免疫抗菌應(yīng)答效應(yīng)相關(guān)。 4. Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌毒力基因的表達(dá)：阻斷細(xì)菌QseC可能會(huì)影響受其調(diào)控的下游基因表達(dá)。我們采用熒光定量PCR檢測受QseC調(diào)控的鼠傷寒沙門氏菌毒力基因的表達(dá)，結(jié)果顯示Br-LED209在200μM濃度時(shí)能夠顯著抑制毒力基因flhDC、sifA和sopB的表達(dá)（P0.001）。 5. Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛動(dòng)力、上皮細(xì)胞侵襲力和細(xì)胞內(nèi)增殖力：鼠傷寒沙門氏菌是致病力極強(qiáng)的腸道致病菌，它通過鞭毛運(yùn)動(dòng)侵襲上皮細(xì)胞，突破上皮防御屏障入侵機(jī)體發(fā)揮致病作用。我們在上述研究中證實(shí)，Br-LED209能夠抑制鞭毛蛋白相關(guān)基因flhDC、侵襲相關(guān)基因sopB，以及增殖相關(guān)基因sifA的表達(dá)。因此，我們進(jìn)一步觀察Br-LED209對鼠傷寒沙門氏菌鞭毛功能、上皮細(xì)胞侵襲能力和胞內(nèi)增殖能力的影響。結(jié)果顯示，Br-LED209能抑制鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛動(dòng)力，從而抑制該菌運(yùn)動(dòng)（P0.05）；顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌對HeLa細(xì)胞的侵襲力，同時(shí)抑制細(xì)菌在HeLa細(xì)胞內(nèi)的增殖（P0.001）。 6. Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除：為了進(jìn)一步探討B(tài)r-LED209降低感染器官中的細(xì)菌數(shù)量的機(jī)理，我們采用鼠傷寒沙門氏菌與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型，進(jìn)一步觀察了巨噬細(xì)胞對鼠傷寒沙門氏菌的免疫應(yīng)答效應(yīng)。結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門氏菌感染的巨噬細(xì)胞，LDH的釋放量顯著增加，PI陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，表明受感染細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，細(xì)胞發(fā)生焦亡。Br-LED209處理后，受感染巨噬細(xì)胞LDH的釋放顯著減少（P0.001），PI染色陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（P0.001），同時(shí)受感染細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目顯著減少（P0.001），提示巨噬細(xì)胞焦亡受到抑制，巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)感染細(xì)菌的清除力增強(qiáng)。 7. Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染引起的巨噬細(xì)胞內(nèi)caspase-1和IL-1β的活化：為了進(jìn)一步探討B(tài)r-LED209如何抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡，我們觀察了感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)炎性復(fù)合體活化相關(guān)蛋白caspase-1和IL-1β的成熟過程。結(jié)果顯示，受感染的巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β釋放顯著增多，Br-LED209處理后，顯著降低感染巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β的釋放（P0.001），提示Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染引起的巨噬細(xì)胞炎性復(fù)合體激活，并可能通過抑制巨噬細(xì)胞焦亡的發(fā)生，恢復(fù)巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的清除能力。 結(jié)論 1. Br-LED209通過阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC群體感應(yīng)系統(tǒng)，抑制flhDC、sifA和sopB等毒力基因表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力、上皮細(xì)胞侵襲能力和胞內(nèi)增殖能力。 2. Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡，恢復(fù)巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的清除功能，該作用可能繼發(fā)于Br-LED209對胞內(nèi)感染細(xì)菌flhDC、sifA和sopB等毒力基因表達(dá)的抑制作用。
[Abstract]:Purpose

Drug - resistant bacterial infection is a very difficult problem in clinical anti - infection treatment , and it is the first cause of serious infection death . At present , antibiotics are still a first - line drug for the treatment of bacterial infectious diseases . However , the development of new antibiotics can not fundamentally solve the problem of bacterial drug resistance . Therefore , the development of new antibiotics does not fundamentally solve the problem of bacterial resistance . Therefore , the development of new antibiotics has become the newest hot spot in the research and development of antibacterial drugs . It represents a new direction for the research and development of new antibacterial drugs .

Group sensing system ( QSS ) is a kind of group behavior regulating and controlling system which is widely existed in bacteria . QseC is widely present in Gram - negative bacteria , and it is involved in regulating the expression of various virulence genes . It has been proved that inhibiting bacteria QseC can significantly inhibit the expression of various virulence factors , reduce the pathogenicity of bacteria . So far , it is not easy to induce the bacteria resistance . So far , it is not easy to induce the bacteria resistance . So far , it is important to study the antibacterial law of QseC inhibitor in vivo .

method

1 . Synthesis and characterization of Br - LED209 selective inhibitor of QseC : 4 - amino - N - ( 4 - Bromophenyl ) benzenesulfonamide was obtained by acylation reaction and deacylation reaction with p - acetamidobenzene sulfonyl chloride and p - bromoaniline . Finally , N - ( 4 - Bromophenyl ) -4 - ( 3 - phenylthiourea ) benzenesulfonamide , i.e . Br - LED 209 , was obtained by thiourization of benzyl isothiocyanate . The structure was identified by mass spectrometry ( MS ) , nuclear magnetic resonance hydrogen ( 1H NMR ) and nuclear magnetic resonance ( 13C NMR ) .

2 . Effects of Br - LED209 on bacterial growth in vitro : The minimal inhibitory concentration ( MIC ) of Br - LED 209 on Salmonella typhimurium , enterohemorrhagic Escherichia coli , EHEC and Shigella flexbility was determined by microdilution method . The effect of Br - LED 209 on bacterial growth was determined by means of automatic growth curve analyzer .

3 . The antibacterial effects of Br - LED 209 in mice infected with Salmonella typhimurium were observed : BALB / c mice were injected intraperitoneally with about 1.0 脳 108 CFU of Salmonella typhimurium to prepare the mouse sepsis model . After infection , the mice were perfused with Br - LEDs at 20 mg / kg for 3 hours . After infection , the mice were sacrificed and the liver , spleen , lungs and kidney were homogenized . The results showed that the liver , spleen , lungs and kidney of infected mice were evenly coated on agar plates .

4 . The effect of Br - LED 209 on the virulence gene expression of Salmonella typhimurium was studied . After 12 hours of incubation of Salmonella typhimurium with 200 渭 - Br - LED 209 , 1 mL of each group was added to 1.5 mlep tube , and the cells were collected by centrifugation at 4 擄 C and 12000 rpm for 2 minutes . The effect of Br - LED 209 on the expression of downstream important virulence factors flhDC , sifa and sopB regulated by QseC group induction system was detected by fluorescence real - time quantitative PCR .

5 . The mechanism of antibacterial action of Br - LED 209 was discussed . The effect of Br - LED 209 on the invasion and proliferation of Salmonella typhimurium was evaluated by inoculating Salmonella typhimurium into semi - solid LB medium containing 0.3 % agar powder .
The effect of Br - LED 209 on the function of macrophage caspase - 1 and IL - 1尾 was evaluated by using 4 ' , 6 - diamidino - 2 - phenylindole ( DAPI ) and propidium iodide ( PI ) . The effect of Br - LED 209 on the function of macrophage inflammatory complex was evaluated by Western blotting Western blotting . The effect of Br - LED 209 on the survival rate of Salmonella typhimurium was evaluated .

Results

1 . The correct structure of QseC selective inhibitor Br - LED209 : The synthesized Br - LED 209 is a pale yellow solid with a melting point of 116 锝

本文編號：1689265