本文選題：LPS　切入點：Hepcidin　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：鐵是人體必需的微量元素之一，正常的腦鐵水平對腦的發(fā)育及生理功能的維持極為重要。腦鐵代謝存在著嚴(yán)格的調(diào)節(jié)機制，但是在炎癥等病理情況下，腦鐵代謝發(fā)生明顯的改變。鐵調(diào)素（Hepcidin）是由肝臟合成并分泌的抗菌肽，其在外周鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。盡管hepcidin主要在肝臟合成，但在鼠類腦部多個腦區(qū)也檢測到hepcidin的表達。Hepcidin在神經(jīng)組織的定位和功能特性提示其在維持腦部鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。然而，內(nèi)源性hepcidin對神經(jīng)元鐵代謝的影響以及在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中的作用尚未闡明。 本研究探討小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞以及內(nèi)源性hepcidin在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中的作用及機制，為進一步增加對腦鐵代謝調(diào)控分子機制的認(rèn)識和內(nèi)源性hepcidin在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中的作用提供依據(jù)。 方法： 1大鼠神經(jīng)細胞的原代培養(yǎng)、純化和鑒定 1.1大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)： 取孕（E16-E18）SD大鼠處死后，取出胎鼠，分離雙側(cè)大腦頂層皮質(zhì)后加入到木瓜蛋白酶中（2mg/ml）37℃消化30分鐘；將組織用進口槍頭（口徑1mm）吹打（約10次），吸出上層單細胞懸液，重復(fù)上述操作兩次，將總的細胞懸液混勻。將細胞懸液以1×105/cm2的密度種入預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理的爬片的24孔培養(yǎng)板和預(yù)先鋪好多聚賴氨酸的6孔細胞培養(yǎng)板中，6-8h后，換成神經(jīng)元培養(yǎng)基Neurobasal，2%B27，以后每3天換半液。 1.2混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)： 取24小時內(nèi)出生的SD乳大鼠，斷頭處死，取全腦分離雙側(cè)大腦頂層皮質(zhì)后加入到木瓜蛋白酶中（2mg/ml）37℃消化30分鐘；用進口槍頭（口徑1mm）吹打（約10次），靜置2min后，吸出上層單細胞懸液，重復(fù)上述操作兩次，將總的細胞懸液混勻。將單細胞懸液以1×105/cm2的密度種入預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理的75cm2培養(yǎng)瓶中，根據(jù)細胞代謝情況，每2～3天換液1次。 1.3星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的純化 星形膠質(zhì)細胞：原代混合膠質(zhì)培養(yǎng)9-10d，待細胞融匯并形成明顯分層，振蕩搖晃18～20h,用無血清DMEM漂洗后，加入胰酶消化下貼壁的扁平的星形膠質(zhì)細胞，接種在6孔板和24孔板培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天換液1次。 小膠質(zhì)細胞：原代混合膠質(zhì)培養(yǎng)9-11d后,待細胞融匯并形成明顯分層，振蕩搖晃2h分離小膠質(zhì)細胞，收集懸液以1000r/min離心7min，棄上清，加定量完全培養(yǎng)液再次吹打成細胞懸液，以1×105/cm2的密度接種于多聚賴氨酸預(yù)先處理的6孔板和24孔板中，置入37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱30min后取出，完全換液1次，以去除未貼壁細胞。 1.4細胞純度鑒定取出不同方法處理后的細胞爬片，免疫細胞化學(xué)和免疫熒光方法鑒定細胞純度。 2采用Hoechst33258熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，MTT比色法，流式細胞術(shù)實驗檢測大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的情況。 3Western-blot方法檢測鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白Tfr1、DMT1、Ferroportin1（Fpn1）、Ferritin H、Ferritin L在神經(jīng)元的表達變化。 4RT-PCR方法檢測IL-6，hepcidin mRNA在不同神經(jīng)細胞中的表達情況。 結(jié)果： 1三種神經(jīng)細胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 1.1原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng) 倒置相差顯微鏡下觀察，細胞培養(yǎng)6h基本貼壁，體積小，立體感強，圓而透亮，極少數(shù)細胞伸出細小的短突起。1d后大部分細胞長出突起，胞體呈圓形或橢圓形，飽滿，光暈明顯。4-6d胞體明顯增大，且開始聚集，突起相連呈網(wǎng)狀樣生長。NeuN抗體染色陽性，陽性細胞純度95%。 1.2混合膠質(zhì)細胞的培養(yǎng) 倒置相差顯微鏡下觀察，細胞培養(yǎng)的1-2d，膠質(zhì)細胞數(shù)量和形態(tài)沒有較大變化，但神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少；細胞培養(yǎng)的3-4d，星形膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增多，胞體鋪展，逐漸成層。神經(jīng)元死亡加速，細胞崩解產(chǎn)物增多；細胞培養(yǎng)的第5-6d開始出現(xiàn)分層生長，下層細胞為胞體較大、扁平、折光性較差的星形膠質(zhì)細胞；上層為體積較小、圓形的小膠質(zhì)細胞；在小膠質(zhì)細胞間會發(fā)現(xiàn)一些有細小突起的圓形細胞，與小膠質(zhì)細胞相比，胞體較小，折光均勻，邊緣光滑，突起多為雙極狀，細胞分布不均，或呈葡萄串樣聚集分布，可能是少突膠質(zhì)細胞系；細胞培養(yǎng)的第9-11d分層更加明顯，培養(yǎng)11d后，星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的數(shù)量和形態(tài)變化不明顯，其它細胞如少突膠質(zhì)細胞數(shù)目則明顯增加。 1.3星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng) 原代混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)9-10d，待細胞融匯并形成明顯分層，振蕩搖晃18～20h,用無血清DMEM漂洗3次，加入0.125%胰酶消化下保留的貼壁的扁平細胞，接種在6孔板和24孔板培養(yǎng)板中。GFAP抗體染色陽性，陽性細胞純度95%。 1.4小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng) 原代混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)9-11d，搖床振蕩2h分離小膠質(zhì)細胞。小膠質(zhì)細胞多在30min內(nèi)貼壁，30min后換液，去除未貼壁細胞。小膠質(zhì)細胞在形態(tài)上多為圓形，邊緣不規(guī)則，培養(yǎng)的第2d可見細胞胞體回縮，少量細胞伸出突起，多為單極，培養(yǎng)3-4d后，可見大多細胞轉(zhuǎn)為靜止?fàn)顟B(tài)，胞體狹長，伸出突起。CD11b抗體染色陽性，陽性細胞純度98%。 2小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞共同參與了LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程 收集LPS處理小膠質(zhì)細胞24h的條件培養(yǎng)基，即為CM1；收集CM1處理星形膠質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基，即為CM3。 2.1Hoechst33258染色檢測神經(jīng)元凋亡情況 以hoechst33258染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，與對照組相比，LPS處理神經(jīng)元6h后，神經(jīng)元的凋亡率無明顯變化；CM1處理神經(jīng)元6h，神經(jīng)元的凋亡率為20.9%，與對照組相比無顯著差異；CM3處理神經(jīng)元6h，神經(jīng)元凋亡率明顯加劇，達到36.7%（P0.01）。 2.2MTT方法檢測神經(jīng)元細胞活力 與對照組相比，LPS處理神經(jīng)元6h，細胞活力未見明顯變化；以CM1處理神經(jīng)元6h，神經(jīng)元活力亦未見明顯下降；以CM3處理神經(jīng)元6h，神經(jīng)元活力明顯下降（P0.01）。 2.3流式細胞術(shù)實驗檢測神經(jīng)元凋亡情況與對照組相比， LPS處理神經(jīng)元6h后，神經(jīng)元的凋亡率無明顯變化；CM1處理神經(jīng)元6h，神經(jīng)元的凋亡率為5.65%，與對照組相比有差異；CM3處理神經(jīng)元6h，神經(jīng)元凋亡率為22.6%，與對照組相比，顯著升高。CM3處理組與CM1處理組相比，凋亡率明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。 3鐵含量及相關(guān)蛋白的變化 3.1鐵含量測定 本實驗采用ICP-MS方法檢測了不同處理后神經(jīng)元內(nèi)的鐵含量。結(jié)果顯示，LPS處理神經(jīng)元6h后，神經(jīng)元內(nèi)鐵含量不增加；CM1處理神經(jīng)元6h后，神經(jīng)元內(nèi)鐵含量也未見顯著增加；CM3處理神經(jīng)元6h后，神經(jīng)元內(nèi)鐵含量顯著增加（P0.01）。提示LPS誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡可能與增加神經(jīng)元內(nèi)鐵含量有關(guān)，且小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞均參與了這一過程。 3.2Tfr1的變化 與對照組相比，LPS處理神經(jīng)元6h，Tfr1蛋白無明顯變化；CM1處理組Tfr1蛋白的表達上調(diào)18.3%（P＜0.01），CM3處理組Tfr1蛋白的表達上調(diào)35.8%（P＜0.01），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 3.3Fpn1的變化 與對照組相比，LPS處理處理神經(jīng)元6h，F(xiàn)pn1蛋白無明顯變化；CM1處理組Fpn1蛋白下調(diào)6.52%（P＜0.05），CM3處理組Fpn1蛋白下調(diào)25.4%（P＜0.01），有統(tǒng)計學(xué)差異。 3.4DMT1的變化 與對照組相比，LPS處理神經(jīng)元6h，DMT1蛋白無明顯變化；CM1處理組DMT1蛋白上調(diào)26.3%（P＜0.001），CM3處理組DMT1蛋白上調(diào)119.5%（P＜0.001），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 3.5H/L-Ferritin的變化 與對照組相比，LPS處理神經(jīng)元6h，H-Ferritin蛋白無明顯變化，CM1處理組H-Ferritin蛋白上調(diào)27.8%（P＜0.001），CM3處理組H-Ferritin蛋白上調(diào)72.4%（P＜0.001），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組相比，LPS處理神經(jīng)元6h，L-Ferritin蛋白無明顯變化，CM1處理組L-Ferritin蛋白上調(diào)22.9%（P＜0.001），CM3處理組L-Ferritin蛋白上調(diào)68.9%（P＜0.001），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 4LPS通過激活小膠質(zhì)細胞釋放IL-6誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞表達hepcidin 4.1LPS誘導(dǎo)hepcidin表達的神經(jīng)細胞類型 對照組三種神經(jīng)細胞hepcidin mRNA的基礎(chǔ)表達量均非常低，LPS（100ng/ml）處理三種神經(jīng)細胞24h后，hepcidin mRNA的表達均無明顯變化。 4.2IL-6對三種神經(jīng)細胞hepcidin mRNA表達的影響 IL-6（10ng/ml）處理三種神經(jīng)細胞24h后，星形膠質(zhì)細胞hepcidinmRNA的表達明顯升高，神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞hepcidin mRNA的表達沒有明顯變化。 4.3LPS對三種神經(jīng)細胞IL-6mRNA表達的影響 LPS處理小膠質(zhì)細胞24h，IL-6mRNA的表達明顯升高，星形膠質(zhì)細胞IL-6mRNA也有升高，但遠低于小膠質(zhì)細胞，而在神經(jīng)元未檢測出IL-6mRNA的表達。 4.4CM1和IL-6分別處理星形膠質(zhì)細胞24h，星形膠質(zhì)細胞hepcidinmRNA表達均明顯升高；在CM1中加入抗IL-6的抗體，再處理星形膠質(zhì)細胞24h，則星形膠質(zhì)細胞中hepcidin mRNA表達的作用受到顯著抑制。 5敲除hepcidin后對神經(jīng)元鐵含量及鐵相關(guān)蛋白的影響 由于純化的星形膠質(zhì)細胞與C6對處理無差別，因此用C6代替了純化的星形膠質(zhì)細胞。將shHepcidin-慢病毒感染C6，封閉內(nèi)源性hepcidin表達，shCtrl-慢病毒感染C6作為對照。以IL-6處理C624h后收集條件培養(yǎng)基，即為CM2′；IL-6處理shCtrl-病毒感染的C624h，收集條件培養(yǎng)基，即為CM2′(+); IL-6處理shHepcdin-病毒感染的C624h，收集條件培養(yǎng)基，即為CM2′(-)。然后分別以IL-6、CM2、CM2′(+)或CM2′(-)處理神經(jīng)元6h，測定神經(jīng)元內(nèi)鐵含量及鐵相關(guān)蛋白的變化。 5.1鐵含量的變化 與對照組相比，IL-6處理組神經(jīng)元內(nèi)鐵有所升高，，但無顯著差異，CM2′、CM2′(+)處理組神經(jīng)元鐵含量顯著升高；與CM2′(+)處理組相比，CM2′(-)處理組神經(jīng)元內(nèi)鐵含量顯著下降。說明敲出星形膠質(zhì)細胞hepcidin可抑制IL-6誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵含量增加，提示星形膠質(zhì)細胞hepcidin是炎癥誘導(dǎo)神經(jīng)元鐵增加的關(guān)鍵因素。 5.2Tfr1的變化 與對照組相比，IL-6處理組和CM2處理組Tfr1蛋白分別上調(diào)39.4%（P＜0.01）和69.7%（P＜0.01），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。與CM2′處理組相比，CM2′(-)處理組Tfr1蛋白下調(diào)39.6%（P＜0.001），CM2′(+)處理組無明顯變化。 5.3Fpn1的變化 與對照組相比，IL-6處理組和CM2處理組Fpn1蛋白分別下調(diào)12.9%（P＜0.05）和37.3%（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)差異。與CM2′處理組相比，CM2′(-)處理組Fpn1蛋白上調(diào)124.4%（P＜0.001），CM2′(+)處理組Fpn1蛋白上調(diào)30.1%（P＜0.001），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 5.4DMT1的變化 與對照組相比，IL-6處理組和CM2處理組DMT1蛋白分別上調(diào)17.1%（P＜0.05）和39.6%（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)差異。與CM2′處理組相比，CM2′(-)處理組DMT1蛋白下調(diào)62.3%（P＜0.001），CM2′(+)處理組DMT1蛋白下調(diào)27.1%（P＜0.01），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 5.5H/L-Ferritin的變化 與對照組相比，IL-6處理組和CM2處理組H-Ferritin蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異。與CM2′處理組相比，CM2′(-)處理組H-Ferritin蛋白下調(diào)62.3%（P＜0.001），CM2′(+)處理組H-Ferritin蛋白下調(diào)19.3%（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組相比，IL-6處理組和CM2處理組L-Ferritin蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異。與CM2′處理組相比，CM2′(-)處理組L-Ferritin蛋白上調(diào)160.0%（P＜0.05），CM2′(+)處理組L-Ferritin蛋白上調(diào)71.3%（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)差異。 6敲除hepcidin后皮層神經(jīng)元凋亡率的變化 以hoechst33258熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，與對照組相比，IL-6處理神經(jīng)元6h，神經(jīng)元凋亡率未見明顯增加，CM2處理組凋亡率明顯升高（P＜0.01）。與CM2′處理組相比，CM2′(-)處理神經(jīng)元6h后，神經(jīng)元凋亡率顯著下降。 結(jié)論： 1小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞均參與了LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程； 2LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡與增加神經(jīng)元內(nèi)鐵含量有關(guān)； 3LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞表達和釋放IL-6，繼而誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞表達hepcidin； 4星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的hepcidin通過抑制神經(jīng)元鐵輸出增加神經(jīng)元內(nèi)鐵含量； 5星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的hepcidin引起的鐵增加是LPS導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的因素。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻】

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1 劉樹欣;劉玉倩;王海濤;秦春;梁國彬;趙斌;;鐵調(diào)素(Hepcidin)對細胞鐵代謝影響的研究進展[J];河北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年01期

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本文編號：1654482