本文選題：異位骨化　切入點(diǎn)：大鼠　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 異位骨化(Heterotopic ossification, HO)是一種軟組織內(nèi)異常的新骨形成,可以導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)功能喪失。它與高鈣血癥引起的轉(zhuǎn)移性鈣化以及營養(yǎng)不良性鈣化不同,因?yàn)镠O形成的是成熟的板層骨結(jié)構(gòu)。目前HO主要有三種類型：創(chuàng)傷性HO、神經(jīng)源性HO、以及遺傳相關(guān)性HO。創(chuàng)傷性HO在臨床上最為常見,主要由髖臼骨折、肘膝肩關(guān)節(jié)的骨折、骨折脫位、以及爆炸和燒傷等損傷性刺激引發(fā)。創(chuàng)傷性HO是骨科相對棘手的問題,術(shù)后患者常見出現(xiàn)疼痛,關(guān)節(jié)活動度下降等臨床表現(xiàn),骨化甚至?xí)䦟?dǎo)致關(guān)節(jié)活動喪失,嚴(yán)重影響到患者生活質(zhì)量。但是對于HO確切發(fā)病機(jī)制仍然不明,因此沒有很好的辦法對其進(jìn)行防控。HO形成的病理生理過程與生理狀態(tài)下骨折愈合的生理過程類似。目前研究表明HO的病理生理進(jìn)程中需要三種必備條件：成骨前體細(xì)胞、刺激誘導(dǎo)因素、持續(xù)的成骨環(huán)境。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HO起源于軟組織內(nèi)的多潛能干細(xì)胞,主要是間充質(zhì)干細(xì)胞,在刺激因素的作用下,局部成骨因子分泌,并且在適宜的成骨環(huán)境下,逐漸向成骨細(xì)胞分化,最終在組織內(nèi)形成新生骨。 目前研究較多的HO相關(guān)成骨因子主要有轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β, TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)、前列腺素(prostaglandin, PG)、堿性成纖維生長因子(Basic f ibroblast growth factor, bFGF)、胰島素樣生長因長(Insulin-like growth factor, IGF)等。1944年P(guān)ederson發(fā)現(xiàn)一種血漿糖蛋白Fetuin-A,屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族,與鈣有很強(qiáng)的親和性,和生物礦化關(guān)系密切。Fetuin-A主要在肝臟合成,在血液中濃度很高,在骨和牙齒等部位聚集。在血液循環(huán)中它可以結(jié)合鈣形成可溶性的鈣-胎球蛋白顆粒,維持礦物離子的穩(wěn)定,防止其聚積,是體內(nèi)最強(qiáng)大的抑制礦化的蛋白質(zhì)。Fetuin-A還對TGF-β和BMPs有拮抗作用,可阻斷TGF-β與其細(xì)胞表面上的受體Tβ RⅡ結(jié)合。在成骨過程中需要大量鈣,這種蛋白可能與HO的發(fā)生存在一定的相關(guān)性,對于HO的防治也可能產(chǎn)生一定的作用,但是目前Fetuin-A與HO的關(guān)系目前國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道很少,也沒有相關(guān)的HO實(shí)驗(yàn)研究探索其在HO過程中血清以及局部異位骨組織中含量的變化。 對于HO的預(yù)防,臨床上尚無確切有效的方法,最為常用治療為非甾體類藥物(NSAIDs)和放射治療。而NSAIDs治療成本低,便于管理用藥,目前仍被廣泛應(yīng)用。NSAIDs治療能有效預(yù)防HO的發(fā)生,但是也存在一些弊端,長期服用會產(chǎn)生產(chǎn)生胃腸道不良反應(yīng),出現(xiàn)胃炎、胃潰瘍,嚴(yán)重者會發(fā)生消化道出血。有骨折的患者若服用會增加骨折不愈合的風(fēng)險(xiǎn)。如何合理使用NSAIDs防治HO的發(fā)生,是目前需要解決的難題。臨床上預(yù)防HO常用的NSAIDs有兩類：非選擇性COX2抑制劑(吲哚美辛)和選擇性COX2抑制劑(塞來昔布)。然而高選擇性的COX2抑制劑是否能更好的預(yù)防異位骨化的發(fā)生,目前仍不明了。 為了驗(yàn)證跟腱切斷HO模型的實(shí)用性,以及探究Fetuin-A與HO的關(guān)系,我們建立了大鼠HO模型,在HO不同階段檢測Fetuin-A在血清及異位骨組織中的變化。另外我們利用大鼠HO模型,比較研究了非選擇性COX2抑制劑(吲哚美辛)和選擇性COX2抑制劑(塞來昔布)在預(yù)防大鼠跟腱切斷后HO的效果。 本文分兩章闡述如下： 第一章異位骨化大鼠模型的建立及相關(guān)蛋白表達(dá)研究 目的大鼠跟腱切斷HO模型是近年來運(yùn)用較多的HO模型,適用于創(chuàng)傷性HO的相關(guān)研究。Fetuin-A則是一種鈣結(jié)合蛋白,在血循環(huán)及組織局部均發(fā)揮著抑制礦化的作用。本章實(shí)驗(yàn)復(fù)制了大鼠跟腱切斷HO模型,以評估該模型的實(shí)用性,并且對Fetuin-A與HO形成的關(guān)系進(jìn)行探討。 方法選取24只雄性Sprague-Dawley大鼠,6-8周齡,體重185.0±10.5g,隨機(jī)分成2組(假手術(shù)對照組和HO模型組,n=12),在無菌條件下,對照組大鼠僅切開皮膚,模型組大鼠切開皮膚后鉗夾并切斷大鼠右側(cè)跟腱造成HO模型。于造模后5,10周對所有大鼠右下肢行X線片攝片,觀察異位骨化發(fā)生情況。在影像學(xué)評估后,第5、10周兩組分別取6只大鼠,處死后取右側(cè)跟腱行病理切片,分別行HE染色,Masson染色,并進(jìn)行免疫組織學(xué)檢查評估COX2、BMP2和Fetuin-A在跟腱局部的表達(dá)水平。分別于手術(shù)操作前隨機(jī)選取6只大鼠,術(shù)后5周和10周兩組大鼠分別選取6只,麻醉后斷尾法取血1m1,采用ELISA定量檢測試劑盒測定血清中Fetuin-A和BALP的含量。 結(jié)果所有大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。術(shù)后5周,對照組大鼠均未出現(xiàn)骨化影,模型組大鼠11只(11/12)出現(xiàn)骨化影；10周時(shí),對照組大鼠均未出現(xiàn)骨化影,模型組大鼠6只(6/6)均出現(xiàn)骨化影。術(shù)后5、10周,對照組大鼠跟腱呈白色,表面光滑,質(zhì)地韌,彈性較好；而模型組大鼠跟腱呈灰白色,表面粗糙,體積較對照組跟腱粗大,質(zhì)地更硬,彈性更差。第5、10周經(jīng)影像學(xué)評估后取跟腱組織行病理學(xué)HE染色,Masson染色,證實(shí)了異位骨組織存在。病理檢查結(jié)果顯示,對照組均未出現(xiàn)H0,模型組12只均出現(xiàn)HO。免疫組織學(xué)檢查：在第5、10周,COX2、BMP2、和Fetuin-A在對照組大鼠跟腱局部的表達(dá)水平組呈現(xiàn)陰性或者弱陽性。在第5周,COX2、BMP2、和Fetuin-A在模型組大鼠可見陽性表達(dá)。在第10周,COX2、BMP2、和Fetuin-A在模型組大鼠可見更強(qiáng)的陽性表達(dá)。血清ELISA檢測：對照組血清Fetuin-A和BALP含量術(shù)前,第5、10周,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；模型組5周和10周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),血清Fetuin-A含量均較術(shù)前明顯降低,且均低于對照組血清Fetuin-A含量(P0.05),血清BALP含量均較術(shù)前明顯升高,且均高于對照組血清BALP含量(P0.05)。 結(jié)論跟腱鉗夾切斷法誘導(dǎo)大鼠HO模型方法簡便,模型成功率高,適用于創(chuàng)傷性HO的研究。血清Fetuin-A在HO形成階段均明顯下降,而另一種HO相關(guān)酶BALP明顯升高,提示Fetuin-A在血循環(huán)不足,對礦化作用的抑制作用的減弱可能是HO形成的潛在原因。在HO的形成過程中,Fetuin-A與COX2和BMP2兩種成骨因子在異位骨中表達(dá)均呈現(xiàn)出陽性,Fetuin-A在異位骨局部聚集提示其可能參與HO的形成。 第二章塞來昔布和吲哚美辛預(yù)防大鼠跟腱HO效果比較 目的吲哚美辛和塞來昔布對HO的預(yù)防均有一定的作用,但塞來昔布的胃腸道副作用更少,本章實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠跟腱切斷HO模型,比較兩種臨床常用的非甾體類藥物選擇性COX2抑制劑(塞來昔布)與非選擇性COX2抑制劑(吲哚美辛)預(yù)防HO形成的效果差異,為挑選出更適合臨床預(yù)防HO的COX2抑制劑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法選取50只雄性Sprague-Dawley大鼠,6～8周齡,體重190.0±8.5g。在無菌條件下,鉗夾并切斷大鼠右側(cè)跟腱造成HO模型。隨機(jī)分成5組(A組,B組,C組,D組,E組,n=10),術(shù)后第1天開始,A、B組分別給予塞來昔布2、10mg/(kg-d),C、D組分別給予吲哚美辛2、0mg/(kg-d), E組給予2mL生理鹽水,共10周,給藥方式為灌胃。術(shù)后觀察大鼠一般情況,于造模后5、10周攝右后肢側(cè)位X線片,觀察新骨形成情況。第10周,大鼠處死后取右側(cè)跟腱組織,行組織學(xué)觀察,并結(jié)合X線片結(jié)果,評定異位骨化形成情況；免疫組織學(xué)化學(xué)染色評價(jià)COX2和BMP-2在跟腱局部表達(dá)水平。 結(jié)果實(shí)驗(yàn)期間共5只大鼠死亡,其中B組2只,C組1只,D組2只,其余大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)完成。各組大鼠異位骨化發(fā)生率,第5周分別為A組：8/10(80%)：B組：2/8(25%)；C組：8/9(88.9%)；D組：4/8(50%)；E組：8/10(80%)；第10周分別為A組：7/10(70%)；B組：2/8(25%)；C組：8/9(88.9%)；D組：4/8(50%)；E組：9/10(90%)。術(shù)后第10周,E組跟腱組織體積最大,質(zhì)地較其他各組硬,可見軟骨樣組織；B組跟腱組織體積顯著小于其他各組,質(zhì)地軟,未見軟骨樣組織；A、C、D組跟腱組織體積及質(zhì)地均介于E、B組間,部分組織中可見軟骨樣組織形成。第10周經(jīng)影像學(xué)評估后取跟腱組織行病理學(xué)HE染色,Masson染色,證實(shí)了異位骨組織存在。組織學(xué)觀察結(jié)果,術(shù)后10周A組8/10例(80%)、B組2/8例(25%)、C組8/9例(88.9%)、D組4/8例(50%)、E組10/10例(100%)HO形成。最終各組間實(shí)驗(yàn)動物HO的發(fā)生率,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0030.05)；組間兩兩比較,發(fā)現(xiàn)B與E組間(P=0.0010.005),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其他各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。免疫組織學(xué)檢查：COX2表達(dá)水平在B組、D組和E組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其它組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); BMP2表達(dá)水平在B組與E組之間,以及在B組與A、C組之間,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其它組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論塞來昔布10mg/(kg·d)的劑量能夠有效降低大鼠術(shù)后異位骨化的發(fā)生率,應(yīng)用塞來昔布2mg/(kg·d)或者吲哚美辛2mg/(kg·d);10mg/(kg·d)三種治療方法對大鼠異位骨化發(fā)生率無明顯抑制作用。塞來昔布和吲哚美辛均能顯著降低HO模型大鼠跟腱COX2表達(dá)水平,而塞來昔布10mg/(kg·d)劑量組對于BMP2表達(dá)抑制作用更好,對成骨活動抑制作用更強(qiáng),塞來昔布可能更適合于臨床預(yù)防HO。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1642873