發(fā)布時間：2018-03-16 00:29

  本文選題：NF-κB　切入點：decoy　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:用單鏈直鏈DNA(ssDNA)自組裝形成載NF-κB decoy ODNs的DNA四面體(TD-dODNs)納米結(jié)構(gòu),并用VCAM-1靶向多肽修飾DNA四面體結(jié)構(gòu),增強TD-dODNs的靶向性,評價該載藥體系在體外和體內(nèi)的抗炎活性。研究方法:用四條單鏈直鏈DNA在體外緩沖鹽溶液中退火自組裝形成DNA四面體,并通過堿基互補配對原則將NF-κB decoy ODNs和VCAM-1靶向多肽修飾在DNA四面體上,制備出具有靶向作用的載NF-κB decoy ODNs的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)(TD-1P-dODNs);用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進行表征,通過瓊脂糖凝膠電泳篩選形成DNA納米結(jié)構(gòu)的最適緩沖鹽濃度;通過瓊脂糖凝膠電泳考察DNA納米結(jié)構(gòu)的凍干穩(wěn)定性和在10%FBS中的穩(wěn)定性;用CCK-8法考察載體材料對巨噬細胞(RAW264.7)和臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的毒性,用LPS刺激RAW264.7和HUVEC建立炎癥細胞模型,用ELISA法檢測DNA四面體載藥體系作用于RAW264.7細胞和HUVEC細胞后產(chǎn)生的炎癥因子,評價其體外抗炎效果;通過共聚焦顯微鏡及流式細胞儀考察載藥體系在RAW264.7細胞和HUVEC細胞的定性攝取和定量攝取;用倒置熒光顯微鏡分析HUVEC的細胞遷移;對小鼠尾根部皮下注射完全弗氏佐劑建立關(guān)節(jié)炎癥模型,采用活體成像技術(shù)考察載藥體系在小鼠體內(nèi)的分布,并于每天給藥,通過小鼠足趾厚度、小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和關(guān)節(jié)的HE染色切片評價載藥體系的體內(nèi)抗炎效果。研究結(jié)果:成功構(gòu)建了靶向載NF-κB decoy ODNs的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠電泳顯示該載藥體系凍干前后能保持結(jié)構(gòu)完整性,且載藥體系(TDdODNs、TD-1P-dODNs)在10%FBS存在下24h能保持一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,相比而言,游離的dODNs在4h時已基本降解。CCK-8法顯示載體材料無細胞毒性,ELISA法檢測結(jié)果顯示細胞炎癥模型成功建立,載藥體系(TD-dODNs、TD-1PdODNs)相比游離dODNs,明顯降低了細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生,亂序dODNs組(TDSODNs)和空白載體TD不能降低細胞炎癥因子的產(chǎn)生。與游離dODNs相比,靶向載藥體系明顯提高了藥物的攝取,4h時,TD-dODNs和TD-1P-dODNs在RAW264.7的細胞攝取量分別為dODNs的2.67倍和2.81倍,在HUVEC的細胞攝取量分別為dODNs的1.91倍和2.63倍。細胞遷移結(jié)果顯示,TD-dODNs和TD-1P-dODNs抑制HUVEC的遷移率分別為31.90%和42.24%,較游離dODNs有明顯差異,亂序dODNs組(TDSODNs)不能抑制HUVEC細胞的遷移。活體成像結(jié)果顯示,TD-dODNs和TD-1P-dODNs增加了藥物在炎癥部位的聚集,體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果顯示,載藥體系對炎癥因子和小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)有一定的降低作用,但未見顯著性差異,可能是由于DNA四面體體內(nèi)穩(wěn)定性較差,降低了體內(nèi)抗炎效果。研究結(jié)論:本實驗構(gòu)建的靶向載NF-κB decoy ODNs的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)能提高游離dODNs的穩(wěn)定性,起到一定的靶向作用,增加了藥物的攝取,提高了藥物的體外抗炎效果,但其體內(nèi)抗炎效果不明顯,需進一步優(yōu)化。
[Abstract]:Objective: to self-assemble the DNA tetrahedron tetrahedron (TD-dODNs) carrying NF- 魏 B decoy ODNs and modify the DNA tetrahedron structure with VCAM-1 targeted polypeptide to enhance the targeting of TD-dODNs. The antiinflammatory activity of the drug carrier system in vitro and in vivo was evaluated. Methods: DNA tetrahedron was formed by annealing of four single strand straight chain DNA in buffer salt solution in vitro. NF- 魏 B decoy ODNs and VCAM-1 targeted polypeptides were modified on DNA tetrahedron by the principle of base complementary pairing to prepare NF- 魏 B decoy ODNs DNA tetrahedron nanostructure, TD-1P-dODNs, agarose gel electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis. The structure was characterized by IR, the optimum buffer salt concentration of DNA nanostructure was screened by agarose gel electrophoresis, the freeze-drying stability and stability of DNA nanostructure in 10s were investigated by agarose gel electrophoresis. CCK-8 method was used to investigate the toxicity of carrier materials to macrophages RAW264.7) and umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Inflammatory cell models were established by LPS stimulation of RAW264.7 and HUVEC. The inflammatory factors produced by DNA tetrahedron loading system on RAW264.7 and HUVEC cells were detected by ELISA method to evaluate its anti-inflammatory effect in vitro. The qualitative and quantitative uptake of drug delivery system in RAW264.7 and HUVEC cells was investigated by confocal microscopy and flow cytometry, and the migration of HUVEC cells was analyzed by inverted fluorescence microscope. The model of arthritis was established by subcutaneous injection of complete Freund's adjuvant into the tail root of mice. The distribution of drug loading system in mice was investigated by using in vivo imaging technique. Mouse arthritis index score and HE staining section of joint were used to evaluate the anti-inflammatory effect of drug carrier system in vivo. Results: the DNA tetrahedron nanostructure targeting NF- 魏 B decoy ODNs was successfully constructed. Agarose gel electrophoresis showed that the drug was loaded. The system can maintain structural integrity before and after freeze-drying. The drug carrier system TDdODNs (TD-1P-dODNs) could maintain a certain structural stability in the presence of 10S for 24 hours. In contrast, the free dODNs was basically degraded at 4h. CCK-8 method showed that the carrier material was not cytotoxic. The results of Elisa showed that the model of cell inflammation was established successfully. Compared with free dODNs, TD-dODNsTD-1PdODNs significantly reduced the production of cytokines TNF- 偽 and IL-6, and the production of inflammatory cytokines was not reduced by dODNs group and blank carrier TD. Compared with free dODNs, TD-dODNs and TD could not reduce the production of cytokines, and compared with free dODNs, TD-dODNs and TD-dODNs could not reduce the production of cytokines. The uptake of TD-dODNs and TD-1P-dODNs in RAW264.7 was 2.67 times and 2.81 times higher than that of dODNs at 4 h. The cell uptake of HUVEC was 1.91 times and 2.63 times of that of dODNs, respectively. The results of cell migration showed that TD-dODNs and TD-1P-dODNs inhibited HUVEC migration rates were 31.90% and 42.24, respectively, which were significantly different from those of free dODNs. In vivo imaging results showed that TD-dODNs and TD-1P-dODNs increased the aggregation of drugs in the inflammatory sites, and pharmacodynamics in vivo showed that the drug delivery system could decrease the inflammatory factors and arthritis index in mice. But there was no significant difference, which may be due to the poor stability of DNA tetrahedron in vivo and the decrease of anti-inflammatory effect in vivo. Conclusion: the DNA tetrahedron nanostructures targeted at NF- 魏 B decoy ODNs can improve the stability of free dODNs. The anti-inflammatory effect was not obvious in vivo and needed to be further optimized because of its targeting effect, increasing the uptake of drugs and improving the anti-inflammatory effect of drugs in vitro.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R943;R965

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本文編號：1617539