本文選題：YL-IPA08　切入點：TSPO　出處：《福建醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：抑郁癥具有高發(fā)病、高自殺、高復發(fā)、高致殘?zhí)攸c,而識別率、就診率、治療率卻較低,其防治成為全球嚴重的公共衛(wèi)生問題和突出的社會問題。目前臨床上用于治療抑郁癥的常用藥物選擇性NE再攝取抑制劑和/或選擇性5-HT再攝取抑制劑(SSRI)雖然具有一定的療效,但毒副作用嚴重。因此,亟待研發(fā)基于新靶標的新型抗抑郁藥物。轉位蛋白18k Da(TSPO)是由五個位于線粒體外膜的跨膜蛋白組成的。TSPO在大腦主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞,與配體結合后可促進膽固醇轉運入線粒體膜內(nèi),從而促進腦內(nèi)神經(jīng)類固醇合成。神經(jīng)類固醇在人類情緒和應激反應調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,在抑郁、焦慮等精神系統(tǒng)疾病的治療中表現(xiàn)出潛在的應用價值。人們注意到,日本三共制藥公司研制了TSPO的特異性配體AC-5216,發(fā)現(xiàn)其在動物模型上具有顯著的抗抑郁、抗焦慮效應,且沒有鎮(zhèn)靜、肌松、認知損傷、戒斷、耐受等安定樣副作用,目前正處于Ⅱ期臨床試驗階段。然而,AC-5216具有難溶于水的不足,生物利用度也較低,且該化合物結構優(yōu)化空間較大。據(jù)此,軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所藥物化學研究室根據(jù)TSPO配體AC-5216進行了結構改造,合成結構全新系列水溶性衍生物,遴選了新化合物YL-IPA08。軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所前期工作提示,YL-IPA08較之于AC-5216,該化合物與TSPO具有更高的親和力、更強的選擇性;在動物模型上,預實驗提示其具有顯著的抗抑郁效應,且無肌松、鎮(zhèn)靜、損傷認知等安定樣不良反應;YL-IPA08生物利用度高(78%),以原型入腦。因此,YL-IPA08具有良好的成藥性。然而,YL-IPA08抗抑郁效應有待于全面評價,其抗抑郁機制有待深入系統(tǒng)探索,以期為其開發(fā)成為具有我國自主知識產(chǎn)權的新型抗抑郁癥藥物提供科學依據(jù)和理論基礎。基于中醫(yī)中藥臨床治療有效性,從中藥有效成分篩選抗抑郁癥藥物,這是我國開發(fā)抗抑郁癥新藥的重要方向與途徑。白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的根,性味苦、酸,微寒,歸肝、脾經(jīng),具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽的功效,主治血虛陰虧、肝陽偏亢及脅肋疼痛、脘腹四肢拘攣作痛諸證。白芍常用于一些中藥復方制劑中如四逆散、逍遙散治療抑郁樣情緒失調(diào)。芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為白芍的主要活性成分。有報道,白芍活性成分芍藥苷具有抗抑郁作用。然而,白芍活性成分芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用及其機制有待研究,以期從中藥白芍尋找新型的抗抑郁癥藥物。基于上述情況,筆者作為福建醫(yī)科大學與軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所聯(lián)合培養(yǎng)的研究生,在軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所進行了新型18k D轉位蛋白(TSPO)配體YL-IPA08的抗抑郁效應及其作用機制、白芍提取物芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁效應及其作用機制研究。本論文主要研究內(nèi)容包括2個部分:1.新型18k D轉位蛋白(TSPO)配體YL-IPA08的抗抑郁效應及其作用機制;2.白芍提取物芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁效應及其作用機制。第一部分新型18k D轉位蛋白(TSPO)配體YL-IPA08的抗抑郁效應及其作用機制抑郁癥病因不明,與遺傳、生物化學、社會、心理、文化等多種因素有關。抑郁癥發(fā)病機制復雜,其發(fā)生可能與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)功能失衡、下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸過度活化、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)低下等因素有關,而HPA軸過度活化可導致腦內(nèi)海馬神經(jīng)元壞死、減少。臨床的抗抑郁藥多數(shù)是通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)功能、抑制HPA軸并增加神經(jīng)營養(yǎng)與可塑性等機制來發(fā)揮治療抑郁癥的作用。神經(jīng)營養(yǎng)與可塑性(主要由BDNF等因子介導)受不同的信號轉導通路調(diào)控,主要包括環(huán)磷酸腺苷(c AMP)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(Ca MK)通路,激活這些通路后最終可以磷酸化環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB),調(diào)節(jié)BDNF等基因表達,從而影響神經(jīng)元存活、神經(jīng)元再生等可塑性改變。本部分研究首先在經(jīng)典抑郁模型-慢性應激大鼠模型上,較為全面評價YL-IPA08的抗抑郁效應;進而從TSPO作用靶點入手,研究其對TSPO表達及其下游神經(jīng)類固醇合成的影響;最后,從神經(jīng)元再生和神經(jīng)可塑性、HPA軸、c AMP通路等角度,較為系統(tǒng)分析YL-IPA08抗抑郁作用的可能機制。主要研究內(nèi)容如下:1.YL-IPA08重復給藥對慢性應激(CUS)大鼠行為學的影響根據(jù)糖水偏嗜度基線把大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性藥AC-5216(0.3mg/kg)組和YL-IPA08低、中、高劑量(0.1,0.3和1.0 mg/kg)處理組。連續(xù)5周以每天1次的頻率給予大鼠一系列不可預知的應激刺激以建立慢性應激模型,對照組不給予任何刺激和藥物,模型組或給藥組在每次刺激前1小時灌胃給予溶劑或陽性藥AC-5216或YL-IPA08 0.1,0.3和1.0 mg/kg,每天1次,連續(xù)給藥35天。在第35天進行糖水偏好試驗,第37天進行開場活動測試,第39天進行新奇抑制攝食測試,第41天進行高架十字迷宮實驗。探討YL-IPA08在慢性應激大鼠抑郁模型上是否具有抗抑郁作用和抗焦慮作用。結果表明,慢性應激導致大鼠糖水偏嗜度降低、開場活動中平行運動次數(shù)和垂直運動次數(shù)減少、攝食潛伏期延長及高架十字迷宮中開臂次數(shù)比例和開臂時間比例減少,表現(xiàn)為“抑郁和焦慮樣行為”,灌胃給予AC-5216后可逆轉這些作用;灌胃給予YL-IPA08可顯著升高大鼠糖水偏嗜度,增加開場水平運動次數(shù)和垂直運動次數(shù),縮短大鼠攝食潛伏期,增加大鼠進入開臂次數(shù)和進入開臂時間的比例,提示YL-IPA08具有顯著的抗抑郁效應。2.YL-IPA08抗抑郁作用機制分析行為學實驗后,每組部分大鼠心臟灌流后取全腦切片進行免疫熒光檢測,部分大鼠取全腦切片進行高爾基染色實驗,剩余所有大鼠取血取腦并分離海馬和前額皮層,進行下述的機制研究。采用蛋白質(zhì)分子印跡法(Western Blot)法檢測大鼠海馬區(qū)TSPO、p-CREB和BDNF的表達,評價YL-IPA08行為效應與TSPO、p-CREB和BDNF表達的關系;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測大鼠血清、海馬和前額皮層孕酮、四氫孕酮和5α-還原酶的含量,評價YL-IPA08的抗抑郁作用與TSPO下游神經(jīng)類固醇的合成量及其合成酶的關系;用ELISA法檢測大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)的含量,評價YL-IPA08的抗抑郁作用與HPA軸的關系;用ELISA法檢測大鼠海馬和前額皮層c AMP含量,評價YL-IPA08的抗抑郁作用與腦區(qū)c AMP含量的關系;用免疫熒光染色法檢測大鼠腦海馬區(qū)Brd U陽性細胞表達量的影響,用高爾基染色法檢測大鼠腦海馬區(qū)椎體細胞樹突總長度和分支節(jié)的影響,分析YL-IPA08抗抑郁作用與大鼠神經(jīng)元再生和神經(jīng)結構復雜性的關系。結果表明,慢性應激組大鼠海馬區(qū)TSPO、p-CREB和BDNF表達明顯減少,伴隨給予YL-IPA08 3個劑量組和陽性對照組AC-5216均能逆轉這種改變,提示YL-IPA08的抗抑郁作用與大鼠海馬區(qū)TSPO、p-CREB和BDNF的表達升高有關。慢性應激組大鼠血清孕酮顯著升高,而海馬和前額皮層腦區(qū)孕酮顯著降低,伴隨給予YL-IPA08 3個劑量組和陽性對照組AC-5216均能逆轉這種改變,慢性應激組血清、海馬和前額皮層腦區(qū)四氫孕酮含量顯著降低,伴隨給予YL-IPA08 3個劑量組和陽性對照組AC-5216均能逆轉這種改變,提示YL-IPA08抗抑郁作用與大鼠海馬和前額皮層腦區(qū)類固醇水平上調(diào)有關。慢性應激大鼠血清中ACTH和CORT含量顯著升高,YL-IPA08 0.3-1.0 mg/kg劑量經(jīng)過5周灌胃給藥后可顯著下調(diào)ACTH的含量,YL-IPA08 0.1 mg/kg劑量組雖然不能顯著降低ACTH的量,但也有降低的趨勢,同時YL-IPA08 3個劑量組均可顯著下調(diào)CORT的含量,提示YL-IPA08抗抑郁作用與其抑制HPA軸有關,作用與陽性藥相當。慢性應激組大鼠海馬和前額皮層腦區(qū)c AMP顯著降低,伴隨給予YL-IPA08和陽性對照組AC-5216均能逆轉這種改變,提示YL-IPA08抗抑郁作用與大鼠腦區(qū)c AMP含量增加有關。免疫熒光染色結果顯示,慢性應激模型組大鼠海馬Brd U陽性細胞顯著減少,伴隨給予YL-IPA08 3個劑量組和陽性對照組AC-5216均能逆轉這種改變;高爾基染色結果顯示,慢性應激模型組大鼠海馬區(qū)錐體細胞樹突總長度和分支節(jié)點明顯縮短和減少,伴隨給予YL-IPA08 3個劑量組和陽性對照組AC-5216均能逆轉這種改變。上述結果提示,YL-IPA08抗抑郁作用與其促進腦內(nèi)神經(jīng)元再生和改變神經(jīng)結構復雜性有關。綜上提示,YL-IPA08具有顯著的抗抑郁效應,其作用機制可能涉及:1.作用于TSPO,促進神經(jīng)類固醇的合成;2.抑制HPA軸的活性;3.增強c AMP-CREB-BDNF通路的作用;4.增強腦內(nèi)神經(jīng)元的再生和神經(jīng)可塑性。第二部分白芍提取物芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁效應及其作用機制抑郁癥發(fā)病機制復雜,大量研究資料表明影響腦內(nèi)單胺遞質(zhì)是抗抑郁作用的重要機制。單胺學說認為5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)是影響抑郁癥的重要因素。目前臨床常用的抗抑郁藥如5-HT和/或NE重攝取抑制劑的作用機制都與其影響腦內(nèi)單胺遞質(zhì)有關。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是一種神經(jīng)生長因子,它主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)并維持其功能,提高BDNF的水平可發(fā)揮抗抑郁作用。鑒此,本部分擬首先在小鼠絕望抑郁模型和大鼠慢性應激模型上確證白芍活性成分芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁效應;進而,從大腦海馬單胺遞質(zhì)的含量和BDNF的表達角度,探討白芍活性成分芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁的作用機制。主要研究內(nèi)容如下:1.芍藥內(nèi)酯苷對小鼠、大鼠抑郁模型的抗抑郁效應小鼠按體重隨機分為對照組、陽性藥鹽酸氟西汀組、芍藥內(nèi)酯苷(3.5,7.0和14.0 mg/kg)劑量處理組。連續(xù)7d灌胃給予雙蒸水、陽性藥鹽酸氟西汀和芍藥內(nèi)酯苷3個劑量組后進行小鼠懸尾、強迫游泳和自發(fā)活動測試,每種測試之間間隔1天,觀察其抗抑郁效應。結果顯示,在小鼠懸尾和強迫游泳中發(fā)現(xiàn)鹽酸氟西汀和芍藥內(nèi)酯苷3個劑量都能夠明顯縮短小鼠懸尾不動時間和游泳不動時間,同時不影響小鼠自發(fā)活動,提示芍藥內(nèi)酯苷在小鼠絕望模型上具有抗抑郁效應。大鼠根據(jù)糖水偏嗜度隨機分為對照組、模型組、陽性藥鹽酸氟西汀對照組、芍藥內(nèi)酯苷(3.5,7.0和14.0 mg/kg)劑量處理組。連續(xù)5周以每日1次的頻率給予大鼠一系列不可預知的應激刺激以建立慢性應激模型,對照組不給予任何刺激和藥物,其他組每次刺激前分別灌胃給予雙蒸水、陽性藥鹽酸氟西汀或芍藥內(nèi)酯苷3個劑量組,在應激結束后檢測大鼠糖水偏嗜度和開場活動。結果顯示,慢性應激導致大鼠糖水偏嗜度降低、開場活動中平行和水平活動次數(shù)明顯減少,伴隨給予芍藥內(nèi)酯苷和陽性對照組鹽酸氟西汀均能逆轉這種改變,提示,芍藥內(nèi)酯苷在慢性應激大鼠抑郁模型上有抗抑郁效應。2.芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁的作用機制行為學測試后,小鼠、大鼠迅速取腦并分離海馬。Western Blot法檢測小鼠、大鼠海馬BDNF表達,探討芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用與海馬區(qū)BDNF水平的關系;高效液相法(HPLC-ECD)檢測海馬區(qū)多巴胺(DA)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、5羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、腎上腺素(AD)、高香酸(HVA)和去甲腎上腺素(NE)的含量,分析芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用與腦內(nèi)單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物水平的關系。結果表明,鹽酸氟西汀和芍藥內(nèi)酯苷3個劑量組灌胃給藥7 d在產(chǎn)生抗抑郁效應的同時可顯著升高海馬BDNF水平。慢性應激導致大鼠海馬區(qū)BDNF水平顯著降低;5周連續(xù)灌胃給予芍藥內(nèi)酯苷3個劑量組和陽性對照組鹽酸氟西汀均能逆轉這種改變,提示芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用與海馬區(qū)BDNF的水平上升有關。慢性應激導致大鼠海馬區(qū)NE、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA顯著降低;5周連續(xù)灌胃給予芍藥內(nèi)酯苷3個劑量和鹽酸氟西汀后可以逆轉這一作用,提示芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用與增加海馬區(qū)5-HT/NE等單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的水平有關。綜上提示,芍藥內(nèi)酯苷具有顯著的抗抑郁作用。其作用機制可能與其增加海馬BDNF和NE/5-HT單胺遞質(zhì)水平有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：1615842