本文選題：羅仙子　切入點：抗氧化肽　出處：《廣東藥科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:皮膚光老化是指皮膚長期受紫外線UVA和UVB輻射而引起的過早衰老的過程。臨床上,以皮膚紋理粗糙,干燥,皺紋增多,松弛,缺乏彈性,有不規(guī)則的色素沉著等為特征。光老化不僅使皮膚功能失調(diào),還與多種皮膚疾病甚至皮膚腫瘤密切相關(guān)。應(yīng)用防曬衣、防曬霜等減少皮膚日光照射量是從源頭上預(yù)防光老化最有效的方法,但亦有很多局限。通過國內(nèi)外文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn),皮膚光老化的發(fā)生與紫外線(UV)誘導(dǎo)過度生成活性氧自由基(ROS)以及炎癥反應(yīng)等有關(guān),而抗炎和抗氧化是防治皮膚光老化的方法之一。家蠅幼蟲(Musca Demestica larvae),俗稱蛆,又名五谷蟲,干燥物系中藥羅仙子,其提取物具有抗菌、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等生物活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),羅仙子富含蛋白提取物還具有一定抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化以及抗衰老等作用。而皮膚光老化的發(fā)生與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān),提示羅仙子提取物可能具有干擾或預(yù)防皮膚光老化發(fā)生的作用。鑒于此,本文以羅仙子為原材料,探索一個合適、便捷的方法提取其中具有抗氧化活性的蛋白或多肽成分,并觀察其對紫外線誘導(dǎo)的皮膚光老化小鼠模型的防護作用,從組織病理學(xué)、氧化應(yīng)激損傷機制、炎癥反應(yīng)等角度初步探討可能的保護機制。研究方法1.羅仙子抗氧化肽的制備工藝研究(1)“提蛋白-酶解法”制備抗氧化肽:采用“堿溶酸沉法”提取羅仙子蛋白,而后用堿性蛋白酶Alcalase對其進行水解,并以DPPH自由基清除率為評價指標,通過單因素和正交試驗優(yōu)化酶解工藝條件;酶解液通過10kDa和5 kDa的超濾膜進行分步分離,分離后各組分進行蛋白或多肽濃度測定以及DPPH自由基清除活性測定,統(tǒng)計得率。(2)“水提醇沉法”制備抗氧化肽:測定水提醇沉后上清DPPH自由基清除活性,測定濃度并計算得率。(3)采用TSKgel G2000SW凝膠柱分析上清和沉淀的分子量分布,通過分子量分布、DPPH自由基清除活性和得率比較以選擇合適的抗氧化肽制備方法。(4)羅仙子抗氧化肽抗氧化活性評價:以強抗氧化劑維生素C(VC)作對照,測定羅仙子抗氧化肽DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基的清除率,并與維生素C對各自由基的半數(shù)清除濃度(EC50)進行比較,評價其抗氧化活性。2.羅仙子抗氧化肽對UV誘導(dǎo)皮膚光老化模型保護作用研究實驗采用56只雌性Balb/c小鼠,將其隨機分為正常對照組(NC)、模型對照組(MC)、基質(zhì)對照組(OC)、羅仙子抗氧化肽低劑量組-2%(L)、中劑量組-4%(M)、高劑量組-8%(H)和維生素E組(VE)。每日給予小鼠背部剃毛處理,外涂給藥處理后1 h進行UVA和UVB照射,每周照射6天,持續(xù)6周,UVA和UVB累積輻照劑量分別為91.2 J/cm2和9.12 J/cm2(模擬日光UVA與UVB的比例)。造模結(jié)束后觀察各組小鼠皮膚外觀并拍照記錄,測定各組小鼠背部皮膚厚度,評價羅仙子抗氧化肽對UV誘導(dǎo)小鼠皮膚光老化模型的保護作用。對小鼠皮膚組織進行HE染色觀察、醛品紅染色觀察、透射電鏡觀察,測定小鼠皮膚組織中MDA含量,SOD、GSH-Px酶活力,金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-1和MMP-3含量,炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量,初步探討羅仙子抗氧化肽對小鼠皮膚光老化模型保護作用可能的機制。研究結(jié)果1.羅仙子抗氧化肽的制備工藝研究(1)“提蛋白-酶解法”制備抗氧化肽:采用“堿溶酸沉法”提取羅仙子蛋白后,單因素試驗和正交試驗確定了羅仙子蛋白最佳酶解工藝條件為:加酶量7000 U/g,底物質(zhì)量濃度1%,酶解反應(yīng)時間15 min,酶解溫度50℃,pH值7.5。酶解液通過10 kDa和5 kDa超濾濾膜分步分離后,共收集到3個分子段組分,分子量范圍分別為MW10 kDa、5 kDaMW10kDa和MW5 kDa,得率依次為9.06±0.14%、2.13±0.04%、1.30±0.02%;3個分子段組分DPPH自由基清除活性均隨濃度的增加而升高,呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系;分子量大于10 kDa的組分清除DPPH自由基活性明顯低于分子量在10 kDa以內(nèi)的組分,MW5kDa的組分活性最強。(2)“水提醇沉法”制備抗氧化肽:水提醇沉后收集上清,多肽得率為13.33±0.31%。(3)兩種方法比較:“堿溶酸沉法”提取上清中含有一定比例的大分子量蛋白,而“水提醇沉法”提取上清中無,為分子量4 kDa左右小肽,提取過程簡單,污染小,得率高,清除DPPH自由基活性強。因此,“水提醇沉法”提取上清中小肽適合制備抗氧化肽。(4)羅仙子抗氧化肽抗氧化活性評價:羅仙子抗氧化肽對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的半數(shù)清除濃度(EC50)分別為0.117、2.232、2.546 mmol/L(以平均摩爾質(zhì)量和質(zhì)量濃度計算所得),VC對各自由基的EC50與抗氧化肽的比值分別為:1∶6.5(DPPH·)、1∶3.97(ABTS·+)和0.84∶1(OH·)。VC是強抗氧化劑,與之對三種自由基的清除活性比較可以看出,羅仙子抗氧化肽亦具有較強的抗氧化活性。2.羅仙子抗氧化肽對UV誘導(dǎo)皮膚光老化模型保護作用研究與正常組相比,模型組小鼠皮膚厚度顯著增加,出現(xiàn)大量紅斑、脫皮現(xiàn)象,膚質(zhì)粗糙、變硬;與模型組相比,羅仙子抗氧化肽中、高劑量組小鼠皮膚厚度明顯降低,紅斑和脫皮減少。HE染色和醛品紅染色結(jié)果顯示,中、高劑量組對UV誘導(dǎo)的角質(zhì)層加厚,角質(zhì)形成細胞過度增殖,排列不規(guī)則,真皮乳頭消失,彈性纖維排列紊亂,斷裂、成團等有一定的改善。與正常組相比,模型組MDA含量顯著上升,SOD和GSH-Px活力顯著降低,MMP-1和MMP-3含量顯著升高,炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高;而與模型組相比,羅仙子抗氧化肽中、高劑量組MDA含量顯著降低,SOD和GSH-Px活力顯著提升,MMP-1和MMP-3含量顯著降低,TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著降低。結(jié)論本文采用“堿溶酸沉法”提取了羅仙子蛋白,并通過單因素和正交試驗確立了羅仙子蛋白最佳酶解工藝條件為:加酶量7000 U/g,底物質(zhì)量濃度1%,酶解反應(yīng)時間15 min,酶解溫度50℃,pH值7.5。采用10 kDa和5 kDa濾膜對酶解液進行分步超濾,其中5 kDaMW10 kDa和MW5kDa的組分清除DPPH自由基活性較強,但得率均比較低�！八岽汲练ā笔占锨逯行》肿与姆肿恿考性�4 kDa左右,無大分子蛋白,得率高,為13.33±0.31%,并且具有較強的清除DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的活性。因此,本文選擇“水提醇沉法”制備抗氧化肽。局部使用羅仙子抗氧化肽對小鼠皮膚光老化模型具有一定保護作用,這種保護作用可能與抑制UV誘導(dǎo)皮膚脂質(zhì)過氧化,提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活力,減少炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達,降低MMPs含量有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R945;R965

【參考文獻】

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本文編號：1600993