發(fā)布時(shí)間：2018-03-11 03:33

  本文選題：抗腫瘤藥物　切入點(diǎn)：免疫毒素　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：癌癥是目前影響人類健康的幾大疾病之一,全球新增癌癥患者及死亡病例近一半出現(xiàn)在中國(guó)。多年來(lái),手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物(細(xì)胞毒藥物)治療是腫瘤治療的三個(gè)主要手段。但是,化療藥物缺乏組織特異性,它同時(shí)也會(huì)殺傷正常的組織細(xì)胞,產(chǎn)生系統(tǒng)毒性�；熕幬镌谀[瘤治療過(guò)程中產(chǎn)生的耐藥性,也是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。近年來(lái),誕生了以腫瘤特征性標(biāo)志成分(腫瘤標(biāo)志物)為靶點(diǎn)的靶向治療藥物。免疫毒素(Immunotoxins)是一類典型的腫瘤靶向治療藥物,它是利用腫瘤標(biāo)志物的單克隆抗體或配體與腫瘤細(xì)胞的特異性親和能力,將與之偶聯(lián)的毒素分子定向輸送到靶點(diǎn)并攻擊腫瘤細(xì)胞,對(duì)機(jī)體的正常的組織、細(xì)胞毒性較小。免疫毒素主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:毒素分子結(jié)構(gòu)域、連桿結(jié)構(gòu)域及靶向結(jié)構(gòu)域。免疫毒素的靶向結(jié)構(gòu)域主要為單克隆抗體或腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的受體的配體。單克隆抗體能與腫瘤細(xì)胞免疫親和,可以用作靶向結(jié)構(gòu)域部分,但其分子量較大,且對(duì)腫瘤組織滲透能力較弱,易產(chǎn)生免疫原性。配體分子同樣能夠?qū)⑴c之偶聯(lián)的毒素分子靶向性輸送到腫瘤細(xì)胞表面,起到特異性殺傷作用。可作為載體的配體主要有白介素系列、腫瘤壞死因子和表皮生長(zhǎng)因子等。配體分子具有分子量低、免疫原性弱、腫瘤組織穿透力強(qiáng)、循環(huán)半衰期短、基因操作方便的優(yōu)點(diǎn)。目前,部分免疫毒素在臨床試驗(yàn)及應(yīng)用中表現(xiàn)出了良好的療效,并且使用劑量低、系統(tǒng)非特異毒性弱。但由于毒素結(jié)構(gòu)域多來(lái)自于細(xì)菌毒素,由此引發(fā)的高免疫原性仍是臨床應(yīng)用的瓶頸。主要體現(xiàn)在腫瘤患者長(zhǎng)期、多次用藥后,體內(nèi)可能產(chǎn)生中和免疫毒素的抗體,從而削弱免疫毒素的抗腫瘤療效,甚至中斷臨床用藥。Onconase是從北美豹蛙卵母細(xì)胞及早期受精卵中分離、純化出的一種分子量為12k Da的蛋白,具有抗腫瘤作用,已在美國(guó)和歐州部分國(guó)家獲得臨床批件,用于間皮瘤的治療。在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用過(guò)程中呈現(xiàn)出如下優(yōu)點(diǎn):可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、可以識(shí)別間皮瘤等幾種腫瘤細(xì)胞、不易產(chǎn)生耐藥性、致敏性低、免疫原性低、副反應(yīng)較輕、無(wú)刺激性,這些特點(diǎn)決定了Onconase具有良好的成藥性和臨床開(kāi)發(fā)前景。為進(jìn)一步提高Onconase對(duì)于非“間皮瘤”腫瘤細(xì)胞靶向性從而增加其應(yīng)用范圍及作用療效,本實(shí)驗(yàn)選擇低免疫原性毒素分子Onconase與配體型靶向結(jié)構(gòu)域V3構(gòu)成重組免疫毒素Onc-V3,以柔鏈(GGGGSGGGGSGGGGS)為連桿,以期取得較原始Onconase療效更高、毒副作用更低的抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p GAPZαA-Onc-V3,表達(dá)了具有Rnase酶活性的重組免疫毒素Onc-V3,并通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)初步探討了Onc-V3的抗腫瘤作用及作用機(jī)制。第一部分:重組表達(dá)質(zhì)粒p GAPZαA-Onc-V3的構(gòu)建。根據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)密碼子,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p GAPZαA-Onc-V3,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中,通過(guò)抗生素篩選、Tricine電泳及PCR鑒定,得到可穩(wěn)定遺傳的含有重組質(zhì)粒p GAPZαA-Onc-V3的多拷貝畢赤酵母工程菌,并確定了畢赤酵母X-33電轉(zhuǎn)化的最佳條件,0.2cm電轉(zhuǎn)杯、1.1k V、200Ω、25μF。進(jìn)行了Western Blot鑒定,并測(cè)定了Onc-V3的Rnase活性,從而進(jìn)一步證明重組免疫毒素Onc-V3能夠在畢赤酵母X-33中正確表達(dá)。對(duì)含有目的蛋白Onc-V3的培養(yǎng)液進(jìn)行了純化,初步確定重組免疫毒素Onc-V3的純化步驟。第二部分:重組免疫毒素Onc-V3的表達(dá)條件優(yōu)化。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基的碳源、氮源、p H和培養(yǎng)溫度對(duì)重組蛋白Onc-V3表達(dá)的影響,篩選出重組免疫毒素Onc-V3的最佳搖瓶表達(dá)條件,即碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨(Peptone)、培養(yǎng)基初始p H為6.5-7.0、溫度為27-30℃。通過(guò)響應(yīng)面分析確定培養(yǎng)液中葡萄糖及蛋白胨的含量對(duì)于目的蛋白Onc-V3的產(chǎn)量有顯著影響,溫度對(duì)目的蛋白Onc-V3的表達(dá)產(chǎn)量有影響。對(duì)Onc-V3的搖瓶發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為因素A碳源(葡萄糖)為21.6g/L,因素B氮源(蛋白胨)為22.25g/L,溫度27℃,p H 6.5。收率較優(yōu)化前提高24%。以此發(fā)酵條件,采用50升發(fā)酵罐發(fā)酵工程菌Onc4,發(fā)酵液經(jīng)離心、硫酸銨沉淀、透析除鹽、親和層析、凝膠過(guò)濾層析后,得酶活性為4161U/L的Onc-V3蛋白溶液,回收率為25.7%。第三部分:重組免疫毒素Onc-V3的抗腫瘤作用及機(jī)制。Onc-V3溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Onc-V3濃度為100μM時(shí)基本無(wú)溶血,此濃度是細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)平均IC50濃度(0.19~0.38μM)的200多倍。用含Onc-V3的培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞48h,結(jié)果顯示Onc-V3對(duì)HEK293細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用,具有較好的安全性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Onc-V3對(duì)A549細(xì)胞、Hep G2細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、Hela細(xì)胞及HO-8910PM細(xì)胞具有較好抑制作用,不同細(xì)胞株其IC50不同,從0.19μM到0.38μM。結(jié)果表明Onc-V3對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用,其效果優(yōu)于原始Onconase。本實(shí)驗(yàn)用Mito Tracker#174;Red CMXR標(biāo)記線粒體、Hochest 33342標(biāo)記細(xì)胞核作為參照,用激光共聚焦顯微鏡觀察FITC-Onc-V3分子發(fā)出的綠色熒光。結(jié)果顯示HO-8910PM細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)散在的線粒體顆粒被染為紅色,環(huán)繞在被Hochest 33342染為藍(lán)色彌散狀細(xì)胞核周圍。綠色熒光的FITC-Onc-V3蛋白分子與呈紅色熒光的線粒體都位于細(xì)胞質(zhì)中,說(shuō)明Onc-V3分子可以靶向腫瘤細(xì)胞、進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)從而發(fā)揮作用。以HO-8910PM細(xì)胞制作細(xì)胞爬片后,用含0.4μM Onc-V3培養(yǎng)基處理48h,經(jīng)DAPI染色后置于熒光顯微鏡下觀察,可見(jiàn)細(xì)胞核皺縮,并聚集成顆粒狀、線狀。說(shuō)明在Onc-V3的作用下,HO-8910PM細(xì)胞發(fā)生了凋亡,細(xì)胞核固縮。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Onc-V3處理后的腫瘤細(xì)胞結(jié)果顯示,Onc-V3作用后的HO-8910PM細(xì)胞發(fā)生了凋亡,不同劑量Onc-V3作用下的HO-8910PM細(xì)胞凋亡率不同,呈明顯劑量依賴性,在劑量達(dá)到1.60μM時(shí)可達(dá)90%的凋亡率。用高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM細(xì)胞進(jìn)行傷口愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Onc-V3對(duì)于HO-8910PM細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示高濃度Onc-V3對(duì)于HO-8910PM細(xì)胞的遷移及對(duì)基底膜的侵襲有抑制作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在Onc-V3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中,PARP、procaspase-9及procaspase-3含量明顯降低,而PARP被切割產(chǎn)生的碎片含量隨Onc-V3劑量增加而變多,caspase-9及caspase-3含量增加,表明Onc-V3可以通過(guò)Caspase途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。綜上所述,本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p GAPZαA-Onc-V3,在畢赤酵母X-33中表達(dá)了重組免疫毒素Onc-V3,在體外實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)地研究了Onc-V3對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用,初步闡明了Onc-V3抗腫瘤作用機(jī)制。本研究證實(shí)Onc-V3對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有靶向性和殺傷性,為Onc-V3的進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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