本文選題：檸檬果膠　切入點(diǎn)：RG-Ⅰ型果膠　出處：《東北師范大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：半乳凝素-3(galectin-3)是一種能夠特異性識(shí)別并結(jié)合β-D-半乳糖苷的凝集素,在腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色,已成為研發(fā)抗腫瘤藥物的靶分子之一。酸堿修飾的檸檬果膠(MCP)是將檸檬果膠經(jīng)過(guò)酸堿處理后得到的產(chǎn)物。無(wú)論是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn),MCP均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。研究表明,galectin-3是MCP的靶分子。MCP通過(guò)和galectin-3結(jié)合,能夠抑制galectin-3介導(dǎo)的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。雖然已有較多MCP活性方面的報(bào)道,但是關(guān)于MCP中的活性成分及其構(gòu)效關(guān)系的研究幾乎為零。因此,本文通過(guò)對(duì)MCP進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)分析,并利用不同的方法對(duì)各級(jí)分進(jìn)行活性檢測(cè),研究了MCP中抑制galectin-3的主要活性成分及其構(gòu)效關(guān)系。研究成果如下:第一,為了全面系統(tǒng)地研究MCP中活性成分與galectin-3的相互作用,我們首先建立并比較了五種方法,用于研究galectin-3與其抑制劑之間的相互作用。結(jié)果表明,(1)生物膜干涉法(BLI)、表面等離子共振法(SPR)、熒光酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制法(cFLISA)和紅細(xì)胞凝集阻抑方法(G3H)均適用于研究果膠類(lèi)抑制劑;(2)熒光偏振法(FP)和G3H法適用于檢測(cè)小分子寡糖類(lèi)抑制劑;(3)雖然各種方法得到的具體數(shù)值存在一定差異,但是抑制劑活性的強(qiáng)弱順序基本一致;(4)每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn),利用多種方法得到的結(jié)果可信度較高。第二,本文利用DEAE-纖維素聯(lián)合Sepharose CL-6B凝膠過(guò)濾柱層析,對(duì)MCP進(jìn)行了分離純化,并利用HPLC、HPGPC以及NMR對(duì)上述分離純化后得到的各級(jí)分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。一共得到了4種酸性雜多糖級(jí)分(MCP-1、-2、-3、-4)和8種均一性較好的子級(jí)分(RG-Ⅰ型果膠:MCP-1a、MCP-2a、MCP-3Sa、MCP-4a;HG型果膠:MCP-2b、MCP-3Sb、MCP-3P、MCP-4b)。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,RG-Ⅰ型果膠主要帶有β-D (1→4)-galactan和α-L-(1→5)-arabinans或I型阿拉伯半乳聚糖聚糖支鏈。利用G3H法,研究了上述各級(jí)分的活性。結(jié)果表明,MCP-2的活性最強(qiáng),約為MCP的10倍。帶有β-D (1→4)-galactan支鏈的RG-Ⅰ型果膠的活性強(qiáng)于其它類(lèi)型的RG-Ⅰ,并且大部分RG-Ⅰ型果膠的活性強(qiáng)于HG型果膠。另外,當(dāng)酸性雜多糖級(jí)分MCP-2被進(jìn)一步分成均一性較好的兩種子級(jí)分(MCP-2a和MCP-2b)后,活性明顯降低,即MCP-2a(RG-Ⅰ型果膠)和MCP-2b(HG型果膠)的活性均弱于母級(jí)分MCP-2。由此推測(cè),RG-Ⅰ和HG可能存在協(xié)同抑制galectin-3的作用。第三,利用多種方法(包括G3H、cFLISA、BLI以及galectin-3誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)),分別從分子水平和細(xì)胞水平上深入研究了MCP中RG-Ⅰ和HG型果膠的協(xié)同作用及其機(jī)制。在抑制galectin-3誘導(dǎo)的紅細(xì)胞凝集和T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,將MCP-2a(RG-Ⅰ)和MCP-2b、MCP-3P(HG)按照質(zhì)量濃度比例分別為1:5和1:8混合時(shí),能夠展現(xiàn)出最強(qiáng)的協(xié)同活性;并且當(dāng)二者按照上述比例混合時(shí),利用BLI檢測(cè)到混合物與galectin-3的作用強(qiáng)度明顯強(qiáng)于二者加和的強(qiáng)度。隨后,我們對(duì)二者產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)HG型果膠能夠特異性結(jié)合galectin-3,并且不同聚合度的HG與galectin-3之間相互作用的強(qiáng)度不同,分子量約為5 kDa時(shí),活性最強(qiáng);(2)只有當(dāng)HG的分子量不小于5 kDa時(shí),才能展現(xiàn)出明顯的協(xié)同活性;(3)HG能夠減弱galectin-3自身的熒光強(qiáng)度,能夠改變galectin-3分子內(nèi)部色氨酸附近的微環(huán)境;(4)乳糖能夠完全抑制MCP-2a與galectin-3之間的結(jié)合,而幾乎不能抑制HG型果膠與galectin-3之間的結(jié)合,推測(cè)RG-Ⅰ型和HG型果膠結(jié)合在galectin-3的不同區(qū)域;(5)RG-Ⅰ和HG型果膠混合后,分子的平均粒徑或空間構(gòu)象發(fā)生了較為明顯的變化,形成了一種新的締合物協(xié)同作用于galectin-3。綜上所述,本文將MCP進(jìn)行了系統(tǒng)分離純化,找到了MCP中結(jié)合galectin-3的活性成分,其中MCP-2的活性最強(qiáng);除此之外,在這些活性成分中,RG-Ⅰ型與HG型果膠展現(xiàn)出協(xié)同抑制galectin-3的作用,同時(shí)對(duì)二者產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制進(jìn)行了研究。上述研究結(jié)果,為MCP活性的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),對(duì)果膠類(lèi)抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有重要的意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R979.1

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本文編號(hào)：1585548