本文關(guān)鍵詞： 肝癌 CD13 Bestatin 4.1-3k　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的肝癌是全球發(fā)病率第五、死亡率第二的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人類的生命。當(dāng)前,肝癌在全球的發(fā)病率呈上升趨勢,中國新增肝癌病例和死亡人數(shù)均居世界首位,約占全球總數(shù)的50%左右。由于肝癌的預(yù)后不佳,因此,需要尋求新的治療手段或藥物。CD13,又稱氨肽酶N(APN),是一種Zn2+依賴的位于細(xì)胞表面的金屬蛋白酶,能夠與從寡肽N末端切除氨基酸的糖蛋白結(jié)合。CD13在多種組織細(xì)胞均有表達(dá),例如神經(jīng)細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等。同時(shí),CD13在急性髓性白血病和多種實(shí)體瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)的現(xiàn)象。因此,該分子又被稱作腫瘤標(biāo)記分子。由于CD13分布范圍廣,且生物學(xué)功能多樣,不僅參與多種生理病理過程,還可作為肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志分子。由于CD13分布廣泛,在臨床治療中需要選擇特異性強(qiáng)的靶向抑制劑進(jìn)行治療,這是研發(fā)新型CD13抑制劑所面臨的最大挑戰(zhàn)。由此,本研究利用分子生物學(xué)手段,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),對我院藥物化學(xué)課題組合成的新的CD13小分子抑制劑4.1-3k在治療肝癌中的作用進(jìn)行了研究,并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討,為臨床治療肝癌以及研發(fā)靶向藥物提供了參考。研究方法1.以肝癌細(xì)胞系為模型,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD13分子在不同細(xì)胞系表面的表達(dá)情況;2.采用 MTT 法檢測 CD13 抑制劑對 HepG2、PLC/PRF/5 以及 HepG2.2.15細(xì)胞增殖能力的影響;PI單染、Annexin V/PI雙染法分別檢測CD13抑制劑對HepG2、PLC/PRF/5以及HepG2.2.15細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響;熒光定量PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡基因Bcl-2、Bax的表達(dá)變化;3.Transwell實(shí)驗(yàn)分析CD13抑制劑對HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞遷移的影響;熒光定量PCR檢測經(jīng)CD13抑制劑處理的HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9的表達(dá);4.血管生成實(shí)驗(yàn)檢測CD13抑制處理HepG2、PLC/PRF/5以及HepG2.2.15細(xì)胞后的血管生成情況;熒光定量PCR檢測經(jīng)CD13抑制劑處理的HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中與血管生成相關(guān)的VEGF、MCP-1等基因的表達(dá);5.Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測 CD13 抑制劑對 HepG2、HepG2.2.15 細(xì)胞 MAPK、NF-κB以及STAT3信號通路基因表達(dá);熒光定量PCR檢測經(jīng)CD13抑制劑處理的HepG2以及HepG2.2.15細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-10等基因的表達(dá);6.流式細(xì)胞術(shù)檢測DEN/CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型、HBV模型、肝癌細(xì)胞荷瘤模型小鼠各個(gè)器官中CD13的表達(dá),統(tǒng)計(jì)經(jīng)CD13抑制劑治療后的荷瘤裸鼠的生存期;7.建立肝癌的肺轉(zhuǎn)移模型,經(jīng)CD13抑制劑治療后觀測肺組織的轉(zhuǎn)移情況;研究結(jié)果1.CD13在不同肝癌細(xì)胞中表達(dá)情況不同,其中含S抗原或HBV基因組的肝癌細(xì)胞系中CD13表達(dá)較高。2.CD13抑制劑顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力,對HepG2.2.15細(xì)胞的作用最為明顯;在高表達(dá)CD13的肝癌細(xì)胞系中,4.1-3k的抑制效果強(qiáng)于對照藥Bestatin。CD13抑制劑處理后,肝癌細(xì)胞凋亡比例增加,4.1-3k在高表達(dá)CD13的肝癌細(xì)胞系中促凋亡效果強(qiáng)于Bestatin,但對細(xì)胞周期無影響。3.CD13抑制劑能夠抑制HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞遷移,且作用效果強(qiáng)于Bestatin。同時(shí),基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9在經(jīng)CD13抑制劑處理后的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。4.CD13抑制劑處理肝癌細(xì)胞后,新生血管的生成明顯受到抑制。在CD13高表達(dá)的肝癌細(xì)胞系中,4.1-3k抑制血管生成作用明顯優(yōu)于Bestatin。同時(shí),血管生成相關(guān)基因VEGF、MCP-1在CD13抑制劑處理后顯著下調(diào)。5.經(jīng)CD13抑制劑處理后,HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中MAPK、NF-κB以及STAT3信號通路相關(guān)基因的活化受到抑制;同時(shí),細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá)顯著下調(diào)。6.DEN/CCL4誘導(dǎo)的肝臟纖維化模型小鼠及HBV模型小鼠中,CD13在免疫負(fù)調(diào)細(xì)胞中表達(dá)較高。經(jīng)CD13抑制劑治療后,HCC荷瘤小鼠中腫瘤的生長受到抑制,生存期延長。7.在BALB/c肺轉(zhuǎn)移模型小鼠中,經(jīng)CD13抑制劑治療后肺結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少,且在4.1-3k組效果最為顯著。結(jié)論及意義本文對新型的CD13小分子抑制劑4.1-3k的抗肝癌作用進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià),發(fā)現(xiàn)4.1-3k可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞生長,同時(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和新生血管的形成,從而發(fā)揮有效的抗HCC作用。體內(nèi)小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),4.1-3k能抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移,大大提高荷瘤小鼠存活率。因此,CD13小分子抑制劑4.1-3k可作為治療肝癌的候選藥物,為研發(fā)更加高效治療肝癌的新藥物提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。
[Abstract]:The purpose of the study is the global liver cancer incidence rate of fifth, second of the mortality rate of malignant tumor, a serious threat to human life. At present, the incidence of HCC in the world is rising, Chinese new liver cancer cases and deaths were ranked first in the world, accounting for about 50% of the global total. Due to poor prognosis of hepatocellular carcinoma, therefore, need to seek treatment or drug.CD13, also known as aminopeptidase N (APN), is located on the cell surface of a metalloproteinase dependent Zn2+, can be combined with resection of glycoprotein amino acids from N terminal peptide.CD13 were expressed in various tissues, such as nerve cells, myeloid cells, endothelial cells and fibroblasts cell. At the same time, CD13 showed high expression in tissue of acute myeloid leukemia and some solid tumors. Therefore, the molecule is called tumor marker CD13. Because of wide distribution, and biological function Diversity, not only involved in a variety of physiological and pathological processes, also can be used as a molecular marker of liver cancer stem cells. Since CD13 is widely distributed in the clinical treatment to choose specificity of targeted inhibitors for treatment, this is the biggest challenge facing the development of novel CD13 inhibitors. Thus, this study by means of molecular biology, in vivo and in vitro the role of our hospital, pharmaceutical chemistry research group of the new 4.1-3k CD13 inhibitors in the treatment of hepatocellular carcinoma were studied, and the mechanism is discussed, for the clinical treatment of liver cancer and the development of targeted drugs provides a reference. 1. research methods on hepatoma cell line model, using flow cytometry cells were detected on the surface of the CD13 molecule expression in different cell lines; 2. were detected by MTT CD13 and the effect of PLC/PRF/5 inhibitor on HepG2, HepG2.2.15 cell proliferation; PI staining, Detection of CD13 inhibitor on HepG2 Annexin V/PI double staining, PLC/PRF/5 and HepG2.2.15 on cell cycle and apoptosis; fluorescence quantitative PCR and Western Blot assay, apoptosis gene Bcl-2, Bax expression changes; analysis of CD13 inhibitor on HepG2 3.Transwell experiment, migration of HepG2.2.15 cells; HepG2 fluorescence quantitative PCR detection with CD13 inhibitor the matrix metalloproteinase MMP2 in HepG2.2.15 cells, the expression of MMP9; 4. angiogenesis assay of CD13 inhibition treatment HepG2, PLC/PRF/5 and angiogenesis of HepG2.2.15 cells; fluorescence quantitative PCR detection with CD13 inhibitor HepG2 and HepG2.2.15 cells and the angiogenesis related gene expression of VEGF, MCP-1 and other CD13 inhibitors; detection 5.Western blot of HepG2 HepG2.2.15 MAPK cell experiment, and the expression of NF- kappa B and STAT3 signaling pathway gene; fluorescence quantitative PCR detection with CD13 inhibitor HepG2 and inflammatory factors in HepG2.2.15 cells IL-6, IL-10 gene expression; liver fibrosis model induced by DEN/CCL4 detection of 6. flow cytometry HBV model, expression of CD13 in hepatoma cells in tumor bearing mice in various organs, statistics by CD13 in nude mice after treatment with inhibitor survival; 7. models of hepatocellular carcinoma lung metastasis, metastasis by CD13 inhibitor after treatment observation of lung tissue; the results of 1.CD13 expression in different liver cancer cells in different HCC cell lines, which containing S antigen or HBV genome in CD13 high expression of.2.CD13 inhibitor significantly inhibited the proliferation of hepatocellular carcinoma cells, the effects on HepG2.2.15 cells obviously; in hepatocellular carcinoma cell line CD13 high expression, 4.1-3k inhibition effect is stronger than the control after drug treatment of Bestatin.CD13 inhibitor, apoptosis of hepatoma cells increased in proportion to 4.1-3k High expression in hepatocellular carcinoma cell line CD13 in the pro apoptotic effect is stronger than Bestatin, but.3.CD13 has no effect on cell cycle inhibitors can inhibit HepG2 and HepG2.2.15 cell migration, and the effect is stronger than that of Bestatin. at the same time, matrix metalloproteinase MMP2, MMP9 in the CD13 treated cells was down regulated in cells treated with.4.CD13 inhibitors. Angiogenesis was significantly inhibited in hepatocellular carcinoma cell lines with high expression of CD13, 4.1-3k inhibited the angiogenesis was significantly higher than that of Bestatin. at the same time, angiogenesis related gene VEGF, MCP-1 inhibitor treatment after CD13.5. was down regulated by CD13 inhibitor, HepG2, MAPK in HepG2.2.15 cells, activation of NF- kappa B and STAT3 signal pathway related genes was inhibited; at the same time, inflammatory factors in IL-6 cells, IL-8 expression was significantly reduced in liver fibrosis model in mice induced by.6.DEN/CCL4 and HBV. In mice, the expression of CD13 was higher in the negative immune cells. After treatment with a CD13 inhibitor, HCC tumor bearing mice inhibited the growth and prolong the survival of.7. in a mouse model of BALB/c lung metastasis, the inhibitor of CD13 after treatment significantly reduced the number of lung nodules, and in the 4.1-3k group had the best effect. Conclusion and the significance of this article on CD13 small molecule inhibitors of 4.1-3k novel anti-tumor effects of systematic evaluation found that 4.1-3k can promote the apoptosis of tumor cells by inhibiting the growth of tumor cells, and can inhibit the migration and angiogenesis of tumor cell formation, so as to play an effective role of anti HCC. Found that the mice experiment, 4.1-3k inhibited the growth of and metastasis of liver cancer, greatly improve the survival rate of tumor bearing mice. Therefore, small molecule inhibitors of CD13 4.1-3k can be used as a drug candidate for the treatment of liver cancer, for development of new drugs more effective in the treatment of hepatocellular carcinoma The material provides experimental data and theoretical support.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：1546897