本文關(guān)鍵詞： CYP SID-MRM-MS miRNA MPPGL 基因多態(tài)性 IVIVE　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)是肝臟的主要藥物代謝酶,參與臨床70%~80%常用藥物的代謝,主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP 2E1、CYP 2D6、CYP 3A4、CYP 3A5等10種亞型。CYP代謝藥物活性的不同是臨床藥物反應(yīng)個(gè)體差異的主要原因,主要表現(xiàn)在酶基因多態(tài)性和含量差異性兩個(gè)方面。CYP基因多態(tài)性的研究成果已得到廣泛認(rèn)可,但尚不足以完全解釋藥物的個(gè)體差異。CYP含量差異性是藥物個(gè)體差異的另一重要影響因素,但正常人肝CYP含量的大樣本研究至今尚無(wú)報(bào)道。究其原因,正常人肝標(biāo)本來(lái)源受限和缺乏準(zhǔn)確可靠的定量方法是困擾CYP研究的重要因素。目前,基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)發(fā)展迅速,穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)-多反應(yīng)監(jiān)測(cè) 質(zhì)譜技術(shù)(Multiple Reaction Monitoring coupled with Stable Isotope Dilution Mass Spectrometry,SID-MRM-MS)已成為目前蛋白質(zhì)定量的較為理想的方法。由于缺乏正常人肝CYP含量標(biāo)準(zhǔn),酶含量差異性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、遺傳及其表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制尚無(wú)法開展系統(tǒng)研究。因此研究正常人肝CYP含量,并探討其轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制,對(duì)進(jìn)一步探討藥物代謝酶對(duì)藥物代謝個(gè)體差異的影響,指導(dǎo)臨床個(gè)體化合理用藥,具有重要的理論和實(shí)際意義。每克肝組織中的微粒體含量(Microsomal Protein Per Gram of Liver,MPPGL)是影響CYP代謝個(gè)體差異的另一重要因素,也是生理藥代動(dòng)力學(xué)模型(Physiologically-Based Pharmacokinetics,PBPK)中將藥物體外代謝清除率推至體內(nèi)清除率過(guò)程中的一個(gè)重要校正因子。為了正確地預(yù)測(cè)藥物體內(nèi)的代謝清除率,需準(zhǔn)確測(cè)定MPPGL的含量及含量的個(gè)體差異,至今尚無(wú)大樣本正常人肝微粒體蛋白生理含量的研究報(bào)道。體內(nèi)體外外推(In Vitro-In Vivo Extrapolation,IVIVE)給研究者提供了在研究體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)之前獲得藥物代謝定量數(shù)據(jù)的機(jī)會(huì)。通常,IVIVE時(shí),用的是各參數(shù)的平均值,只能得到單點(diǎn)的體內(nèi)清除率,常常導(dǎo)致預(yù)測(cè)的偏差。如果用參數(shù)的個(gè)體數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè),即可得到體內(nèi)清除率的范圍,降低預(yù)測(cè)的偏差,為臨床提供更加可靠的數(shù)據(jù)。本課題擬以已收集的正常人肝標(biāo)本為研究對(duì)象,采用q PCR的方法,對(duì)107例正常人肝10種CYP的m RNA進(jìn)行定量;采用SID-MRM-MS對(duì)100例正常人肝10種CYPs亞型含量進(jìn)行定量,明確正常生理范圍,發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異程度;對(duì)107例正常人肝中調(diào)控CYPs各種亞型的轉(zhuǎn)錄因子及mi RNA進(jìn)行定量,從轉(zhuǎn)錄水平及表觀遺傳學(xué)角度闡述影響酶含量的機(jī)制;選用特異性探針,研究10種CYP亞型水平的酶動(dòng)力學(xué),明晰藥物代謝的個(gè)體差異程度。對(duì)10種CYP亞型進(jìn)行基因分型,明確基因多態(tài)性對(duì)CYP含量及活性的影響,發(fā)現(xiàn)基因型對(duì)個(gè)體差異的影響程度。另外,測(cè)定128例正常人肝MPPGL的含量,明確正常生理范圍,發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異程度;測(cè)定10種CYP在微粒體水平與肝臟水平的代謝活性,比較兩種活性之間的差異。另外,用78例樣本MPPGL、CLint等5種參數(shù)個(gè)體數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)CYP2C9探針?biāo)幬锛妆交嵌‰弩w內(nèi)肝清除率的個(gè)體差異,以期為基于PBPK的體內(nèi)清除率預(yù)測(cè)提供生理參數(shù)。1方法1.1人肝標(biāo)本收集128例肝功能正常的人肝組織樣本。其中男性40例,女性88例,平均年齡47.2歲。吸煙或飲酒者各13例。1.2人肝微粒體的制備及微粒體蛋白含量的測(cè)定差速離心法制備人肝微粒體(Human Liver Microsome,HLM),采用Bradford法測(cè)定微粒體蛋白濃度。1.3 CYP基因多態(tài)性的測(cè)定選擇在中國(guó)漢族人群中基因多態(tài)性發(fā)生頻率在1%以上的位點(diǎn),對(duì)10種CYP亞型進(jìn)行基因分型,共25個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),用SNP Mass ARRAY分型檢測(cè)。1.4熒光定量PCR測(cè)定m RNA及mi RNA的表達(dá)將1μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,兩步法在7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增。mi RNA定量先將1μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5倍稀釋后三步法在進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.5 SID-MRM-MS測(cè)定人肝微粒體CYP亞型蛋白的含量將10種CYP亞型的特異性肽段序列整合在一個(gè)Qcon CAT蛋白序列中,用大腸桿菌表達(dá)同位素標(biāo)記該蛋白序列,純化后,和待測(cè)樣品一起酶切,脫鹽后Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀進(jìn)行SID-MRM-MS分析定量。1.6 10種CYP亞型酶活性的測(cè)定100μl的人肝微粒體孵育體系中分別加入不同濃度的系列CYP的特異性底物、EDTA、磷酸鹽緩沖液、氯化鎂等,37°C預(yù)孵育后加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng),后加冰乙腈、乙酸乙酯或高氯酸終止反應(yīng),用HPLC-UV或HPLC-FLD進(jìn)行分析測(cè)定。1.7 MPPGL含量測(cè)定通過(guò)同時(shí)測(cè)定同一樣品肝勻漿及HLM中的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(POR)的活性計(jì)算MPPGL。MPPGL(mg/g)=每克肝臟POR活性/每毫克HLM的POR活性=nmol Cyt.c min-1 g-1/nmol Cyt.c min-1mg-11.8甲苯磺丁脲肝清除率的預(yù)測(cè)先將甲苯磺丁脲的體外清除率(CLint,in vitro)轉(zhuǎn)化成整肝清除率(CLint,liver),再用充分?jǐn)嚢枘Ｐ瓦M(jìn)行預(yù)測(cè),用每一例樣本的5種參數(shù)(MPPGL,CLint,in vitro,LW,QH及BW)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè),得到體內(nèi)肝清除率的范圍。預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度用AFE(Average Fold-error,平均誤差倍數(shù))判定。1.9統(tǒng)計(jì)方法SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Prism 5.0軟件作圖。因本實(shí)驗(yàn)大部分?jǐn)?shù)據(jù)為非正態(tài)分布,用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1人肝中10種CYP的表達(dá)2.1.1人肝微粒體中CYP亞型蛋白含量100例正常人肝中10種CYP亞型含量均呈非正態(tài)分布。含量為4.62(CYP2B6)到102.04pmol/mg(CYP2E1)(中位數(shù)),CYP3A4含量個(gè)體差最大,129倍,其它CYP含量差異倍數(shù)為11~100倍。除了7對(duì)CYP之外,其它的CYP亞型蛋白含量之間均有顯著性相關(guān)性(P0.05)。2.1.2 10種CYP m RNA的表達(dá)100例正常人肝中10種CYP的m RNA均呈非正態(tài)分布。相對(duì)表達(dá)水平0.19(CYP2D6)到5.94(CYP2E1)(中位數(shù))。CYP2A6表達(dá)水平個(gè)體差異倍數(shù)最大,168倍,其它CYP m RNA表達(dá)水平差異倍數(shù)為8~122倍。除了4對(duì)CYP之外,其它的CYP m RNA表達(dá)水平之間均有顯著性相關(guān)性(P0.05)。2.1.3 CYP m RNA與相應(yīng)蛋白之間的相關(guān)性只有CYP1A2、CYP2A6的m RNA與蛋白含量具有顯著相關(guān)性(P0.01)。2.2 CYP表達(dá)水平的影響因素2.2.1轉(zhuǎn)錄因子4種轉(zhuǎn)錄因子PXR、HNF4α、CAR及AHR的m RNA水平均呈非正態(tài)分布,表達(dá)水平均較低,但個(gè)體差異較大,從12到85倍。除PXR與AHR之外,其它的轉(zhuǎn)錄因子m RNA的表達(dá)水平之間均有顯著相關(guān)性(P0.05)。除了AHR與CYP2C9、CYP2D6之外,其它的轉(zhuǎn)錄因子與CYP在m RNA表達(dá)水平之間均有顯著性相關(guān)性(P0.05)。轉(zhuǎn)錄因子的m RNA表達(dá)水平與CYP的蛋白含量之間的相關(guān)性較差。2.2.2 mi RNA 7種mi RNA表達(dá)水平均呈非正態(tài)分布。其中mi RNA-27b在肝組織中的表達(dá)豐度最高,mi RNA-34a豐度較低。mi RNA-27b個(gè)體差異達(dá)618倍,其它mi RNA的差異倍數(shù)為89~312倍。7種mi RNA之間均有顯著性相關(guān)性(P0.019)。mi RNA與CYP的m RNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P0.05);mi RNA與與部分CYP的蛋白含量有顯著相關(guān)性;mi RNA與CYP的蛋白翻譯效率無(wú)著性相關(guān)(P0.05)。2.2.3基因多態(tài)性CYP基因多態(tài)性對(duì)m RNA的影響CYP1A2-3113AG、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2D6 100CT(*10)、CYP2D6 1661GC、CYP3A5 AG(*3)突變對(duì)m RNA表達(dá)水平有顯著影響(P0.05)。CYP基因多態(tài)性對(duì)蛋白含量的影響CYP1A2 5347CT、CYP1A2 2159GA、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2C9*3、CYP2D6*10、CYP2D6 1661GC、CYP2E1-1293GC、CYP2E1 7632TA、CYP2E1-333TA與CYP3A5 AG突變對(duì)蛋白含量有顯著影響。2.2.4人口學(xué)因素男性組CYP1A2的m RNA表達(dá)水平顯著高于女性組(P=0.014);隨著年齡的增加CYP2B6、CYP3A4、CYP2C8、CYP2C9及CYP2C19的m RNA表達(dá)水平下降(P0.05);隨著年齡的增加,CYP3A5蛋白含量明顯增加(P0.05)。2.3 10種CYP亞型水平活性90例樣本中10種CYP亞型的Vmax、Km和CLint活性均呈非正態(tài)分布。10種CYP Km為1.9~230.4μm/L(中位數(shù)),Vmax為1.2~21pmol/min/pmol CYP(中位數(shù)),CLint為0.012~10.8μl/min/pmol CYP(中位數(shù))。10種CYP亞型酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在大的個(gè)體差異,Vmax的個(gè)體差異9~1697倍;CLint為23~625倍;Km個(gè)體差異相對(duì)較小,為3~40倍。除CYP2C19之外,其它的CYP亞型水平Vmax之間均有顯著性相關(guān)性(P0.05)。除了CYP2C19與5種CYP,CYP3A5與4種CYP均無(wú)相關(guān)性之外,其它的CYP亞型水平CLint之間均有顯著性相關(guān)性(P0.05)。10種CYP亞型Km之間的相關(guān)性較差,僅7對(duì)CYP之間有相關(guān)性(P0.05)。2.4基因多態(tài)性對(duì)10種CYP亞型水平活性的影響CYP1A2 5347CT、CYP1A2 2159GA、CYP2A*4、CYP2A6*9、CYP2D6*10、CYP2D6 1661GC及CYP3A5*3對(duì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)有顯著影響(P0.05)。2.5 MPPGL含量128中國(guó)正常人肝樣本的MPPGL呈非正態(tài)分布。MPPGL的平均含量為39.46 mg/g liver,范圍6.71到127.95mg/g liver,個(gè)體差異19倍。性別、年齡、吸煙、飲酒及臨床診斷對(duì)MPPGL含量均無(wú)顯著影響(P0.05)。2.6 CYP微粒體水平與肝組織水平活性10種CYP微粒體水平的活性(轉(zhuǎn)化速率)31.50~677.94pmol/min/mg protein(中位數(shù)),個(gè)體差異6~232倍。用每個(gè)個(gè)體微粒體水平的活性乘以其相對(duì)應(yīng)的MPPGL的含量,代表每克肝組織水平CYP的活性(轉(zhuǎn)化速率)。肝組織水平CYP活性0.96-29.05 nmol/min/g liver,個(gè)體差異23~210倍。除了CYP2C19之外,肝臟水平CYP活性的個(gè)體差異均高于微粒體水平。9種CYP肝臟水平活性個(gè)體差異的倍數(shù)變化比相對(duì)應(yīng)的微粒體水平活性的個(gè)體差異倍數(shù)分別高18%~278%。與微粒體水平活性相比,肝臟水平的活性在10種CYP中的每一種都有較大的位次改變。CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9和CYP2E1,分別有47%、41%、40%和41%的樣本位次變化幅度超過(guò)20%。2.7甲苯磺丁脲體內(nèi)肝清除率的預(yù)測(cè)7種方法預(yù)測(cè)的甲苯磺丁脲的肝清除率的平均值均為0.113 ml/min/kg,但預(yù)測(cè)范圍區(qū)間則有明顯的差異。方法G為目前通用的預(yù)測(cè)方法,用各種參數(shù)的平均值預(yù)測(cè),僅僅得到肝清除率的預(yù)測(cè)平均值;本實(shí)驗(yàn)所用的方法A,78例樣本每個(gè)個(gè)體的5種參數(shù),預(yù)測(cè)出甲苯磺丁脲的肝清除率的變異區(qū)間0.012~0.558 ml/min/kg,個(gè)體差異51倍。結(jié)論1.提供了正常人肝10種CYP亞型蛋白及微粒體蛋白含量的正常值,兩者均有明顯個(gè)體差異。2.提出新的CYP活性表示方法。亞型水平活性代表CYP的真正活性,肝組織水平的CYP活性更接近體內(nèi)情況。3.提出了預(yù)測(cè)體內(nèi)肝清除率個(gè)體差異的新方法,采用體外人肝微粒體蛋白含量等個(gè)體數(shù)據(jù),成功預(yù)測(cè)了CYP2C9探針?biāo)幬锛妆交嵌‰弩w內(nèi)肝清除率的個(gè)體差異。4.CYP基因多態(tài)性對(duì)CYP亞型蛋白及活性個(gè)體差異的影響較大,而mi RNA及人口學(xué)因素影響較小。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
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本文編號(hào)：1515370