本文關(guān)鍵詞： 佐劑性關(guān)節(jié)炎 MiR-152 DNMT1 MeCP2 Wnt信號(hào)　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫異常的、系統(tǒng)性多關(guān)節(jié)性疾病,成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA病理機(jī)制中起關(guān)鍵作用。Wnt信號(hào)影響RA病理機(jī)制,對(duì)RA病理發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Masala等研究發(fā)現(xiàn)在脊髓發(fā)育不良的髓細(xì)胞,分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(Secreted Frizzled-Related Protein4, SFRP4)發(fā)生表觀遺傳學(xué)修飾致其表達(dá)降低,誘發(fā)Wnt信號(hào)激活。在RA病理變化中,是否也存在SFRP4表達(dá)變化,Wnt信號(hào)影響RA的病理變化是否與SFRP4有關(guān)?佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis, AA)具有與RA相似的病理學(xué)、免疫學(xué)特點(diǎn),是理想的RA動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)采用AA大鼠作為RA研究動(dòng)物模型,研究SFRP4在對(duì)照組大鼠和AA大鼠滑膜中的表達(dá)變化,及其對(duì)Wnt信號(hào)的影響,深入研究在AA病理中SFRP4基因發(fā)生的表觀遺傳學(xué)修飾,揭示甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein2, MeCP2)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1, DNMT1)對(duì)SFRP4表達(dá)的影響,以及microRNA(miR)-152在其中發(fā)揮的重要作用,為RA的研究與防治提供新的思路。研究?jī)?nèi)容主要包括以下五個(gè)部分： 1. SFRP4在AA大鼠滑膜中的表達(dá),及其與Wnt信號(hào)的關(guān)系。 免疫組化、RT-PCR和Western blotting檢測(cè)SFRP4在對(duì)照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達(dá)變化,分離培養(yǎng)對(duì)照大鼠和AA大鼠FLS, RT-PCR和Western blotting檢測(cè)SFRP4在對(duì)照大鼠和AA大鼠FLS中的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,SFRP4在AA大鼠滑膜組織和FLS中表達(dá)均顯著降低,提示異常表達(dá)的SFRP4可能對(duì)AA病理機(jī)制發(fā)揮調(diào)控作用。為了研究SFRP4在AA大鼠中對(duì)Wnt信號(hào)的調(diào)控作用,分離培養(yǎng)對(duì)照大鼠滑膜FLS,培養(yǎng)液中加入SFRP4抗體,采用real time qPCR和Western blotting檢鋇SFRP4抗體對(duì)對(duì)照大鼠FLS Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SFRP4抗體顯著上調(diào)對(duì)照大鼠FLS的β-catenin表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證SFRP4對(duì)Wnt信號(hào)的影響,AA大鼠FLS培養(yǎng)液中加入重組SFRP4蛋白,Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組SFRP4蛋白能顯著抑制AA大鼠FLS的β-catenin、fibronectin表達(dá)。提示SFRP4可能通過(guò)抑制Wnt信號(hào)影響AA病理變化。 2.DNA甲基化特異性抑制劑(5-aza-2'-deoxycytidine,5-azadC)對(duì)AA大鼠SFRP4表達(dá)的影響。 采用RT-PCR、Western blotting、MTT等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)5-azadC刺激AA大鼠FLS對(duì)SFRP4表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5μM,5.0μM,7.5μM劑量的5-azadC分別刺激AA大鼠FLS均能顯著上調(diào)SFRP4表達(dá),5μM5-azadC分別刺激培養(yǎng)AA大鼠FLS24、48、72h后SFRP4表達(dá)均顯著升高,提示AA病理中SFRP4基因可能發(fā)生了DNA甲基化修飾致其表達(dá)降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能顯著抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin、ccndl表達(dá)。同時(shí)5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能顯著抑制fibronectin表達(dá)和AA大鼠FLS增殖。上述結(jié)果綜合提示,AA病理中SFRP4低表達(dá)可能與SFRP4基因發(fā)生了DNA甲基化修飾有關(guān),而5-azadC能上調(diào)SFRP4表達(dá),進(jìn)而能抑制β-catenin、ccnd1、fibronectin表達(dá),表明SFRP4可能通過(guò)Wnt信號(hào)通路影響AA病理變化。 3. MeCP2對(duì)AA大鼠SFRP4表達(dá)的影響 采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)MeCP2在對(duì)照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,MeCP2在AA大鼠滑膜組織中表達(dá)顯著升高,RT-PCR和Western blotting檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),在AA大鼠FLS中,MeCP2表達(dá)顯著高于對(duì)照。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siMeCP2至AA大鼠FLS,研究MeCP2表達(dá)抑制對(duì)SFRP4表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeCP2表達(dá)抑制后,SFRP4表達(dá)顯著升高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,AA病理中異常高表達(dá)的MeCP2可能與抑制SFRP4表達(dá)有關(guān)。 4. DNMT1對(duì)AA大鼠SFRP4表達(dá)的影響 Real time qPCR和Western blotting檢測(cè)DNMT1在對(duì)照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,在AA大鼠滑膜組織中DNMT1表達(dá)顯著上調(diào),real time qPCR和Western blotting檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DNMT1在AA大鼠FLS中的表達(dá)顯著高于對(duì)照,DNMT1表達(dá)抑制后SFRP4表達(dá)顯著升高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,AA病理中異常高表達(dá)的DNMT1可能與SFRP4表達(dá)下調(diào)有關(guān)。 5.MiR-152對(duì)AA大鼠SFRP4的作用及信號(hào)通路 采用real time qPCR、Western blotting、MTT等方法檢測(cè)miR-152在對(duì)照大鼠和AA大鼠中的表達(dá)差異及其對(duì)DNMT1表達(dá)的影響,進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)的miR-152對(duì)SFRP4表達(dá)的影響,對(duì)Wnt信號(hào)的影響和對(duì)AA的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-152在AA大鼠中表達(dá)顯著下調(diào),過(guò)表達(dá)的miR-152抑制DNMT1的表達(dá),上調(diào)SFRP4的表達(dá),抑制經(jīng)典Wnt信號(hào),抑制AA大鼠FLS異常增殖。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,miR-152具有抑制AA的作用,并且這種抑制作用可能是通過(guò)對(duì)DNMT1表達(dá)的抑制和對(duì)Wnt信號(hào)的抑制實(shí)現(xiàn)的。 綜上所述,在AA大鼠中SFRP4基因可能發(fā)生表觀遺傳學(xué)修飾致其表達(dá)降低,進(jìn)而引發(fā)Wnt信號(hào)激活,促進(jìn)AA的發(fā)生發(fā)展。在AA大鼠中高表達(dá)的DNMT1和MeCP2可能抑制SFRP4表達(dá),而低表達(dá)的miR-152可能與DNMT1的高表達(dá)相關(guān),DNMT1, MeCP2和miR-152對(duì)AA大鼠SFRP4低表達(dá)發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1510654