本文關(guān)鍵詞： 阿帕替尼 BRAF V600E 非小細(xì)胞肺癌 HPLC-MS/MS 藥物相互作用 絞股藍(lán)總苷 P-gp CYP3A4 CYP2D6 藥動學(xué)　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與目的肺癌是目前發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤,其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)約占80%-85%。近年來其發(fā)病率仍呈現(xiàn)不斷上升趨勢,嚴(yán)重威脅著人民的健康。由于大多數(shù)患者在確診時已為不可手術(shù)的中晚期,需要進(jìn)行藥物治療。根據(jù)患者個體情況給予合適的靶向制劑是改善預(yù)后的有效手段,因此針對靶向制劑的研究具有重要意義。阿帕替尼是我國首個完全自主研制的1.1類抗腫瘤藥物,在體內(nèi)主要通過原型高效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子2(Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)發(fā)揮抗腫瘤活性,目前在胃癌的治療中具有良好的安全性和有效性。此外,其臨床前研究和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)了較好的抗肺癌活性,大大提高了患者的緩解率,延長了中位無進(jìn)展生存期,具有良好的市場應(yīng)用前景。然而,阿帕替尼在臨床應(yīng)用中仍存在以下問題:1)其它VEGFR2抑制劑對肺癌患者的臨床療效與阿帕替尼在臨床試驗(yàn)中的結(jié)果差別較大,表明阿帕替尼的抗腫瘤作用機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步研究確認(rèn);2)臨床治療中,其成本-效益比遠(yuǎn)超患者支付意愿,對醫(yī)療資源利用率不高,臨床應(yīng)用比較局限。因此,發(fā)現(xiàn)阿帕替尼的作用靶點(diǎn)并闡述其作用機(jī)制,以及降低成本效益比,對推動阿帕替尼在臨床應(yīng)用中的個體化治療,從而改善患者預(yù)后,具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)與腫瘤的侵襲、遷移、新生血管的生成等密切相關(guān),也已成為抗腫瘤藥研究中的重要靶點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。課題組前期基于Life公司的LanthaScreen binding和ZLYTE平臺,檢測其對各蛋白激酶的作用活性,并結(jié)合各激酶在肺癌中的意義,初步確定了鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)V600E突變蛋白為其潛在靶點(diǎn);此外,研究表明,藥物暴露量與藥物作用密切相關(guān),針對藥代動力學(xué)的藥物相互作用是改變藥物暴露量,改善成本-效果比的重要手段。本研究以BRAF V600E突變的NSCLC細(xì)胞株HCC364為對象,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該靶點(diǎn),闡明阿帕替尼作用途徑;同時,開展絞股藍(lán)總苷(gypenosides,GP)干預(yù)阿帕替尼體內(nèi)藥動學(xué)的動物實(shí)驗(yàn),以期提高其暴露量,改善成本-效果比。從而推進(jìn)阿帕替尼在臨床治療中的個體化給藥進(jìn)程,造福更多患者。實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果1.用CCK8(Cell Counting Kit-8)法檢測阿帕替尼對HCC364(BRAF V600E突變)和HCC827(BRAF V600E野生)的增殖抑制活性,分析數(shù)據(jù)并計算各組細(xì)胞IC50值。結(jié)果顯示,hcc364和hcc827細(xì)胞ic50分別為84.1nm和1024.1nm,其中阿帕替尼對hcc364的敏感性約為hcc827細(xì)胞的12倍,提示阿帕替尼對brafv600e突變的nsclc細(xì)胞具有更好的活性抑制作用。2.測定阿帕替尼對hcc364細(xì)胞周期、凋亡和遷移的影響。結(jié)果顯示,與空白對照組比較,10,20和50nm阿帕替尼處理48h,能使hcc364細(xì)胞周期阻滯于g1期且促進(jìn)其凋亡和抑制其遷移,且阿帕替尼的這些作用呈梯度依賴,提示阿帕替尼具有抑制brafv600e突變的非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展和惡化的潛力;3.免疫印跡法(westernblotting)分析阿帕替尼對braf腫瘤調(diào)控通路的影響。用50nm阿帕替尼處理hcc364細(xì)胞不同時間(0,15,30,60和120min),westernblotting分析細(xì)胞中braf下游蛋白絲裂原活化蛋白激酶的胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinase/extracellularsignal-regulatedkinasekinase,mek)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,erk)的磷酸化。結(jié)果顯示藥物作用30min后能夠顯著抑制mek和erk的磷酸化,提示阿帕替尼抑制hcc364細(xì)胞活性可能與braf/mek/erk通路抑制有關(guān)。4.裸鼠皮下接種hcc364細(xì)胞建立體內(nèi)brafv600e突變的nsclc荷瘤模型,模型成功后,通過灌胃給藥,觀察不同劑量阿帕替尼(32,65,100mg/kg·d)體內(nèi)抑瘤作用和效果,實(shí)驗(yàn)設(shè)置維羅菲尼(250mg/kg·d)對照組。結(jié)果顯示,維羅菲尼(250mg/kg·d)和不同劑量的阿帕替尼(32,65和100mg/kg·d)均能有效抑制腫瘤生長,抑瘤率分別為48.73%,51.58%,70.19%和72.49%。表明阿帕替尼在體內(nèi)對brafv600e突變的nsclc具有良好的增殖抑制作用,且呈劑量依賴,其中低劑量阿帕替尼給藥組的腫瘤抑制效果高于維羅菲尼對照組。瘤體蛋白檢測數(shù)據(jù)表明,維羅菲尼和阿帕替尼給藥組動物瘤體內(nèi)mek和erk蛋白的磷酸化程度均有所降低。5.建立一套同時檢測大鼠血漿中阿帕替尼原型及主要代謝產(chǎn)物(m1-1、m1-2、m1-6和m9-2)的hplc-ms/ms方法,并依據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局(u.s.foodanddrugadministration,fda)和中國藥典最新版的相關(guān)規(guī)定完成了方法驗(yàn)證。結(jié)果顯示,選擇性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、稀釋效應(yīng)、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)各指標(biāo)均符合相關(guān)規(guī)定,所建立分析方法能在1-2000ng/ml范圍內(nèi)對大鼠血漿中阿帕替尼及其代謝產(chǎn)物藥物濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量,為考察絞股藍(lán)總苷對阿帕替尼藥動學(xué)的影響提供技術(shù)支持與保障。6.觀察不同劑量gp對阿帕替尼藥動學(xué)的影響。結(jié)果顯示,給予高劑量gp(400mg/kg)后,可使阿帕替尼原型及其代謝產(chǎn)物的暴露量顯著增加,使m0、m1-1、m1-2和m1-6的auc0-24h分別升高為原來的3.53、2.69、2.53和1.90倍。此外,高劑量gp還可以降低阿帕替尼的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。表明絞股藍(lán)總苷可以顯著改變阿帕替尼的藥動學(xué)過程,增加體內(nèi)暴露量。結(jié)論1.首次發(fā)現(xiàn)阿帕替尼對BRAF-V600E突變的NSCLC活性抑制具有極好的選擇性,初步闡明阿帕替尼抑制BRAF V600E突變的NSCLC細(xì)胞的作用機(jī)制,即抑制BRAF/MEK/ERK腫瘤調(diào)控通路。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了上述調(diào)控通路,并提示阿帕替尼對BRAFV600E突變的NSCLC的抑制效果優(yōu)于維羅菲尼。2.在動物水平,絞股藍(lán)總苷可以干預(yù)阿帕替尼的藥動學(xué)過程,提高阿帕替尼原型和Ⅰ相代謝產(chǎn)物暴露量,該聯(lián)合應(yīng)用方案具有降低阿帕替尼治療成本的潛力,為開展阿帕替尼聯(lián)合用藥方案的后續(xù)研究提供了依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1508474