本文關(guān)鍵詞： 髓性白血病 MAT1 CAK-RARα信號通路 粒向分化 基因轉(zhuǎn)錄　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分MAT1表達/切割對正常及惡性造血細(xì)胞增殖/分化的調(diào)控作用及其機制研究目的：髓性白血病是一類造血系統(tǒng)的克隆性惡性疾病,其發(fā)病機制尚未完全闡明且治療效果有待提高。參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和基因轉(zhuǎn)錄的MAT1蛋白在正常造血干細(xì)胞的粒向分化過程中發(fā)生切割,但其在全反式維甲酸(ATRA)耐藥的髓性白血病細(xì)胞中則以全長形式高表達,提示MAT1的表達和切割與正常及惡性造血細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān),但其調(diào)控機制尚不明確。本部分研究將以MAT1、正常造血干細(xì)胞和髓性白血病細(xì)胞為研究對象,系統(tǒng)探討MAT1的表達和切割對正常及惡性造血細(xì)胞體內(nèi)外增殖和分化的影響,并闡明相關(guān)作用機制。方法：本研究采用CD34+細(xì)胞(人源性造血干/祖細(xì)胞)、原代髓性白血病細(xì)胞和可傳代的髓性白血病細(xì)胞株作為研究對象。(1)血球計數(shù)板結(jié)合臺盼藍(lán)染色法計數(shù)細(xì)胞數(shù)目,從而計算細(xì)胞生存率、死亡率與倍增時間；(2)采用分子克隆手段構(gòu)建全長MAT1和其切割片段pM9質(zhì)粒,并產(chǎn)出使細(xì)胞過表達MAT1和pM9的慢病毒；(3)Western Blotting法檢測蛋白的表達和磷酸化水平；(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜表面特異性抗原CD11b、CD66、CD34和CD19的表達量,或在動物模型中檢測表達GFP熒光蛋白的細(xì)胞比例；(5)qRT-PCR法檢測MAT1、 CD11b、CD66等mRNA轉(zhuǎn)錄水平；(6)瑞姬染色檢測細(xì)胞核形態(tài)的改變；(7)免疫熒光法檢測MAT1和p21Cip/Kip蛋白在CD34+細(xì)胞中的表達量；(8)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測MAT1切割片段的氨基酸序列,以推測MAT1的切割位點；(9)免疫沉淀檢測多種蛋白之間的結(jié)合水平；(10)HE染色和免疫組化染色檢測組織切片中特定蛋白的表達和腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果：(1)MAT1促進CD34+細(xì)胞擴增并抑制其粒向分化采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在CD34+細(xì)胞中過表達MAT1后,發(fā)現(xiàn)MAT1的過表達不僅可拮抗內(nèi)源性MAT1的切割降解,并且促進了CD34+細(xì)胞的體外擴增。與此同時,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MAT1抑制細(xì)胞表達成熟粒細(xì)胞表面標(biāo)記物CD66和CDl lb,瑞姬染色也證實MAT1過表達可抑制細(xì)胞核在ATRA誘導(dǎo)下出現(xiàn)粒細(xì)胞特異性的分葉狀形變,提示 CD34+細(xì)胞的體外擴增和粒向分化受MAT1表達的調(diào)控。為進一步明確MAT1在體內(nèi)對CD34+細(xì)胞的影響,將人源性間充質(zhì)干細(xì)胞與CD34+細(xì)胞共接種于免疫缺陷的NSG小鼠,從而構(gòu)建適宜CD34+細(xì)胞在體分化的微環(huán)境。通過流式細(xì)胞分選結(jié)合qRT-PCR分析,發(fā)現(xiàn)MAT1的過表達不僅促進CD34+細(xì)胞在骨髓內(nèi)的歸巢和在外周血中的擴增,而且抑制了細(xì)胞中CDllb和CD66的轉(zhuǎn)錄與表達,揭示MAT1在體內(nèi)也具有促進CD34+細(xì)胞擴增并維持其干細(xì)胞特性的作用。由于上述過程伴隨著細(xì)胞周期抑制蛋白p21Cip/Kip表達量的降低,提示MAT1可能通過下調(diào)p21Cip/Kip的表達促進造血干細(xì)胞擴增并且抑制其粒向分化。(2)MAT1的活性切割片段pM9通過調(diào)控CAK和TFIIH活性抑制髓性白血病細(xì)胞的惡性演進采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析全長MAT1和其切割片段M30的氨基酸序列,對比發(fā)現(xiàn)MAT1在C末端發(fā)生切割,從而產(chǎn)生M30和pM9兩個片段。經(jīng)分子克隆技術(shù)構(gòu)建Flag標(biāo)記的pM9質(zhì)粒后,采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在HL60、HL60R和Jurl-MKl三株髓性自血病細(xì)胞中過表達pM9,發(fā)現(xiàn)pM9不僅可降低內(nèi)源性MAT1的表達,而且可與內(nèi)源性MAT1競爭性結(jié)合cyclin H和CDK7從而構(gòu)成ACAK。由于pM9不具備結(jié)合TFIIH XPD和XPB所需的結(jié)構(gòu)域,ACAK無法與TFIIH核心結(jié)合從而構(gòu)成完整的TFIIH激酶,因此pM9形成的ACAK能顯著抑制內(nèi)源性CAK和TFIIH的形成。進一步研究發(fā)現(xiàn),pM9可抑制原代AML細(xì)胞和髓性白血病細(xì)胞株的體外增殖并促進原代細(xì)胞的粒向分化。Western Blotting結(jié)合qRT-PCR結(jié)果顯示,上述作用可能是通過降低CDK7的磷酸化從而抑制CAK對下游蛋白CDK1和RARa的磷酸化激活,并且干預(yù)TFIIH介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。但pM9的上述抑制作用僅局限于髓性白血病細(xì)胞,而對正常造血干細(xì)胞的擴增無明顯影響,造成其敏感性差異的原因可能是pM9對RNA Pol II磷酸化水平的調(diào)控,以上結(jié)果提示pM9具有良好的腫瘤靶向性。在NSG小鼠白血病移植瘤模型中,pM9可模擬ATRA介導(dǎo)的MAT1切割,抑制ATRA耐受的髓性白血病細(xì)胞在體內(nèi)的增殖與轉(zhuǎn)移。結(jié)論：MAT1的表達促進造血干細(xì)胞的擴增并抑制其粒向分化,而MAT1的活性切割片段pM9可模擬MAT1的切割并形成ACAK,從而影響內(nèi)源性CAK和TFIIH的形成與活性,最終特異性地抑制髓性白血病細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。第二部分基于低磷酸化RARaS77抑制ATRA耐藥的t(8;21)AML細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的抗白血病增殖作用機制研究目的：非APL的急性髓性白血病(AML)細(xì)胞中的CAK-RARa信號通路阻滯是患者對ATRA分化療法不敏感的原因之一。第一部分研究已經(jīng)證實了MAT1的活性切割片段pM9可形成ACAK,從而減少內(nèi)源性CAK對RARa的磷酸化并抑制髓性白血病細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)移。在本部分研究中,將以ATRA耐藥的t(8;21)AML為研究對象,考察RARa的磷酸化水平對基因轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞增殖的影響,進而探討RARa的磷酸化與白血病細(xì)胞耐受ATRA之間的相關(guān)性和分子機制,為設(shè)計基于干預(yù)RARa磷酸化的全新抗白血病藥物提供思路及潛在靶點。方法：本研究采用原代t(8;21)AML細(xì)胞和可傳代的t(8;21)AML細(xì)胞株作為研究對象。(1)采用分子克隆手段構(gòu)建Flag標(biāo)記的RARa和RARaS77A質(zhì)粒,并產(chǎn)出使細(xì)胞過表達RARa和RARaS77A的慢病毒；(2)血球計數(shù)板結(jié)合臺盼藍(lán)染色法計數(shù)細(xì)胞數(shù)目,從而計算細(xì)胞生存率和死亡率；(3)DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡時的核小體片段；(4)Western Blotting法檢測蛋白的表達和磷酸化水平；(5)qRT-PCR法檢測mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和表達GFP熒光蛋白的細(xì)胞比例；(7)免疫沉淀檢測多種蛋白之間的結(jié)合水平；(8)HE染色和免疫組化染色檢測組織切片中特定蛋白的表達和腫瘤細(xì)胞的形態(tài)；(9)染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合qPCR分析特定蛋白對靶基因轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果：持續(xù)低磷酸化的RARaS77突變體RARaS77A在多種髓性白血病細(xì)胞中的過表達可促進多種與細(xì)胞分化和凋亡相關(guān)的RA靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而抑制細(xì)胞的體外增殖并誘導(dǎo)ATRA耐受的t(8;21)AML細(xì)胞株發(fā)生凋亡,而合用ATRA可進一步增強RARaS77A誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。在去除培養(yǎng)體系中的維甲酸或給予靶向RARa配體結(jié)合域的RARa抑制劑Ro 41-5253后,發(fā)現(xiàn)RARaS77A引起的細(xì)胞增殖抑制和促RA靶基因轉(zhuǎn)錄的作用未受影響。以上結(jié)果在原代t(8;21)AML細(xì)胞中也得到證實,提示RARaS77A的作用不依賴于配體作用以及RARa配體結(jié)合域的激活。將過表達RARaS77A的t(8;21)AML細(xì)胞株SKNO-1接種于免疫缺陷的NSG小鼠中,或同時給予ATRA后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓和外周血中SKNO-1細(xì)胞的比例,發(fā)現(xiàn)與空白載體組相比,RARaS77A單獨或與ATRA合用均能顯著抑制SKNO-1細(xì)胞在骨髓和外周血中的增殖,并且抑制細(xì)胞向淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。為進一步闡明低磷酸化的RARaS77是如何調(diào)控RA靶基因轉(zhuǎn)錄從而抑制t(8;21)AML細(xì)胞增殖,采用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測RARaS77A、RARa、RNA Pol Ⅱ和ETO等蛋白與RA靶基因RARE區(qū)域的結(jié)合。結(jié)果顯示,RARβ2等RA靶基因的轉(zhuǎn)錄激活伴隨著RARaS77A與靶基因RARE區(qū)域結(jié)合的增強,RNA Pol Ⅱ、TFIIH p89的募集和AMLl/ETO、HDACl、 DNMT3a的解離,提示RARaS77A可能通過改變RA靶基因啟動子區(qū)域附近的抑制性染色質(zhì)構(gòu)型從而促進基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論：RARaS77位點的低磷酸化可能通過改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)型,以ATRA非依賴的方式誘導(dǎo)多種調(diào)控細(xì)胞分化和凋亡的RA靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而抑制ATRA耐藥的t(8;21)AML細(xì)胞的惡性增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：1507124