本文關鍵詞： 丙酮酸脫氫酶激酶 腫瘤 Hsp90抑制劑 高內涵分析 二氯乙酸　出處：《南昌大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：不同類型的腫瘤可能有不同的遺傳背景，但在大多數(shù)腫瘤細胞中，其共同特征表現(xiàn)為腫瘤代謝異常，主要體現(xiàn)為有氧糖酵解的增強和氧化磷酸化的抑制。異常的代謝特征為腫瘤細胞快速增殖及凋亡缺陷提供了內環(huán)境基礎，使得腫瘤細胞在其相適應的環(huán)境中存活并發(fā)生快速增殖。因此，靶向腫瘤代謝成為目前國際上抗腫瘤治療的新策略。丙酮酸脫氫酶激酶（PDHK）作為控制糖酵解和氧化磷酸化通路的關鍵節(jié)點激酶，其在腫瘤細胞的快速增殖、侵襲、遷移及凋亡抵抗等過程中發(fā)揮著重要的作用。PDHK在多種腫瘤組織中異常表達，且其異常表達與腫瘤患者對放化療治療的敏感性、耐藥產生、預后以及存活期等密切相關。因此，PDHK已成為靶向腫瘤代謝抗腫瘤策略中極具潛質的靶點，但目前還未有比較理想的抑制劑。 方法：本研究在前期已建立的PDHK抑制劑分子水平篩選模型（PDHK1~4）的基礎上，建立了基于高內涵分析的細胞水平高通量篩選模型（人非小細胞肺癌NCI-H1299）。采用靶向PDHK的ATP結合口袋抑制劑發(fā)現(xiàn)策略，基于PDHK和Hsp90蛋白ATP口袋結構高度相似的研究基礎，特定針對已知Hsp90抑制劑的母核進行定向設計，改造合成兩類化合物，并在已建立的分子和細胞篩選模型上對獲得的化合物進行靶向性篩選和藥效學評價。 結果：靶向性篩選首先在分子篩選模型上對基于Hsp90抑制劑定向設計的包括改造異惡唑側鏈和苯環(huán)上取代基兩類共300個化合物進行初步篩選，發(fā)現(xiàn)43個對PDHK1有良好抑制活性的化合物；對活性較好的化合物進一步采用高內涵分析和蛋白免疫印跡方法測定其細胞活性，發(fā)現(xiàn)5個對PDHK1有良好抑制活性的化合物。在此基礎上，藥效學研究上評價了5個活性化合物的亞型特異性，發(fā)現(xiàn)兩類化合物的代表化合物MT-ACT-216和Yhhu-3803均對PDHK四個亞型有較好的抑制作用，，且MT-ACT-216能有效影響腫瘤細胞的代謝特征，包括明顯減少乳酸的生成、增加腫瘤細胞的相對氧耗量、ATP和ROS的產生等。Yhhu-3803能明顯增加腫瘤細胞ROS的產生。進一步，采用TMRM染色法檢測化合物對細胞線粒體膜電位的作用，發(fā)現(xiàn)MT-ACT-216和Yhhu-3803均能降低線粒體膜電位，提示活性化合物有可能是通過降低線粒體膜電位這一機制誘導腫瘤細胞的凋亡。進一步采用磺酰羅丹明B（Sulforhodamine B，SRB）比色法檢測化合物對腫瘤細胞的增殖效應，發(fā)現(xiàn)MT-ACT-216和Yhhu-3803對腫瘤細胞的增殖有抑制作用。 結論：綜上所述，本研究在已建立的篩選平臺上篩選得到靶向PDHK的兩個先導化合物MT-ACT-216和Yhhu-3803。通過對其藥理學進行研究，揭示了靶向PDHK的化合物可能是通過改變腫瘤細胞代謝依賴性，抑制腫瘤細胞生長。以上研究結果為同類化合物的深入研究提供了詳盡的實驗證據(jù)，同時為靶向PDHK抑制劑的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)提供了嶄新的思路。
[Abstract]:Objective: different types of tumors may have different genetic backgrounds, but in most tumor cells, their common characteristics are abnormal metabolism. The abnormal metabolic characteristics provide the internal environmental basis for the rapid proliferation and apoptosis defects of tumor cells, which are mainly reflected in the enhancement of aerobic glycolysis and the inhibition of oxidative phosphorylation. That allows tumor cells to survive and proliferate rapidly in their adaptive environment. Targeted tumor metabolism has become a new strategy of antitumor therapy in the world. Pyruvate dehydrogenase kinase (PDHKK) is a key node kinase in the control of glycolysis and oxidative phosphorylation pathway, and its rapid proliferation and invasion in tumor cells. PDHK plays an important role in the process of migration and apoptosis resistance. The abnormal expression of PDHK in various tumor tissues is associated with the sensitivity and drug resistance of tumor patients to radiotherapy and chemotherapy. The prognosis and survival time are closely related, so PDHK has become a potential target in the anti-tumor strategy of tumor metabolism, but there is no ideal inhibitor at present. Methods: in this study, the molecular level screening model of PDHK inhibitors was established. A high throughput screening model at cell level (NCI-H1299A) was established based on high intension analysis (NCI-H1299A). The detection strategy of ATP combined with pocket inhibitor targeting PDHK was used. Based on the highly similar pocket structure of PDHK and Hsp90 protein ATP, a high throughput screening model was established for human non-small cell lung cancer (NCI-H1299A). Specific targeted designs were carried out for the mother nuclei of known Hsp90 inhibitors, two kinds of compounds were synthesized and targeted screening and pharmacodynamics evaluation were performed on the established molecular and cell screening models. Results: targeting screening was performed on a molecular screening model. Three hundred compounds including modified isooxazole side chain and substituted groups on benzene ring were selected based on Hsp90 inhibitor orientation design. It was found that 43 compounds with good inhibitory activity to PDHK1 and those with good activity were further determined by high intension analysis and Western blotting. Five compounds with good inhibitory activity to PDHK1 were found. On the basis of this, the specific subtypes of the five active compounds were evaluated in pharmacodynamic studies. It was found that both MT-ACT-216 and Yhhu-3803, the representative compounds of the two compounds, could inhibit the four subtypes of PDHK, and that MT-ACT-216 could effectively affect the metabolic characteristics of tumor cells, including significantly reducing the production of lactic acid. Yhhu-3803 could significantly increase the production of ROS in tumor cells by increasing the relative oxygen consumption of tumor cells and the production of ROS. Further, the effect of compounds on mitochondrial membrane potential was detected by TMRM staining. It was found that both MT-ACT-216 and Yhhu-3803 could decrease mitochondrial membrane potential. These results suggest that the active compounds may induce apoptosis of tumor cells by decreasing mitochondrial membrane potential, and the proliferative effect of these compounds on tumor cells was further examined by sulfonyl rhodamine (BX) Sulforhodamine BHSRB colorimetry. It was found that MT-ACT-216 and Yhhu-3803 could inhibit the proliferation of tumor cells. Conclusion: in conclusion, two leading compounds, MT-ACT-216 and Yhhu-3803, were screened on the established screening platform. The pharmacology of the two leading compounds MT-ACT-216 and Yhhu-3803 were studied. The results suggest that the compounds targeting PDHK may inhibit the growth of tumor cells by changing the metabolic dependence of tumor cells. These results provide detailed experimental evidence for the further study of similar compounds. At the same time, it provides a new idea for the discovery and development of targeted PDHK inhibitors.
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R965.1

【共引文獻】

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本文編號：1496204