本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)性毒劑 效應(yīng)標(biāo)志物 膽堿酯酶加合物 酶解-質(zhì)譜法 重活化劑　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：神經(jīng)性毒劑(nerve agents,NAs)主要包括塔崩(GA)、沙林(GB)、梭曼(GD)、VX和俄羅斯VX(RVX),是一類對神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)具有強(qiáng)抑制作用的有機(jī)磷酸酯類化合物。神經(jīng)性毒劑可被用于制造恐怖事件的可能性凸顯了對其毒理機(jī)制及醫(yī)療救治研究的重要性。根據(jù)其中毒機(jī)制,神經(jīng)性毒劑暴露后最有效的急救手段是及時給予乙酰膽堿酯酶重活化劑。然而,梭曼中毒酶易老化、難重活化且尚無有效重活化劑是世界防化醫(yī)學(xué)亟待解決的科學(xué)難題。目前對于神經(jīng)性毒劑中毒特性及重活化劑效價的研究主要依賴于經(jīng)典的Ellman酶活力測定法。然而,該方法存在諸多不足,例如易受基質(zhì)、藥物等干擾,導(dǎo)致表征結(jié)果不準(zhǔn)確;更為重要的是該方法不能展示乙酰膽堿酯酶中毒后及重活化過程中的演變規(guī)律。隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展,各種高靈敏的NA水解產(chǎn)物、大分子加合物等生物標(biāo)志物的分析方法已能夠滿足NA中毒確證和溯源的要求。本課題借鑒蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)策略,首次提出了針對NAs毒性靶點(diǎn)AChE加合物即NAs效應(yīng)標(biāo)志物的分析技術(shù)方法,將現(xiàn)代儀器分析技術(shù)應(yīng)用于NA毒性分析。具體而言,本課題基于酶解-質(zhì)譜法的分析策略,將中毒效應(yīng)酶AChE經(jīng)胃蛋白酶酶解后產(chǎn)生三種含有活性加合肽段的相應(yīng)效應(yīng)標(biāo)志物,即活性肽、中毒肽和老化肽,并建立其高效液相色譜-串級質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)定量測定技術(shù)。為了能“捕捉”效應(yīng)酶在中毒及重活化過程中的實(shí)時演變或存在狀態(tài),經(jīng)一系列試驗(yàn)考察,發(fā)現(xiàn)向體系中加入適量甲酸可使效應(yīng)酶瞬間“凍結(jié)”。相比傳統(tǒng)酶活力測定法,本方法不僅能給出效應(yīng)酶中毒程度的數(shù)據(jù),更能定量地獲取效應(yīng)酶中毒后所處的不同狀態(tài),特別是對于低劑量神經(jīng)性毒劑暴露(效應(yīng)酶抑制率小于20%)時,Ellman法無法準(zhǔn)確判斷酶活性抑制率,而本方法則可準(zhǔn)確分析抑制率小于1%的情況�；谒⒌拿附�-質(zhì)譜分析方法,我們首先表征了四種經(jīng)典神經(jīng)性毒劑(塔崩、沙林、梭曼、VX)的中毒特性,計算了各NAs的中毒速率常數(shù)、老化速率常數(shù)及老化半衰期。隨后,應(yīng)用上述分析技術(shù),評價了經(jīng)典重活化劑(HI-6、雙復(fù)磷、氯磷定、TMB-4和MMB-4等)、我所研發(fā)的新型重活化劑和復(fù)方藥物對這四種神經(jīng)性毒劑分別暴露后的中毒乙酰膽堿酯酶的重活化效價,并評價了預(yù)防藥物的預(yù)防給藥效果,探討了藥物的重活化作用機(jī)制。本課題建立的分析方法同樣可用于其他類化合物(如膽堿酯酶抑制劑吡啶斯的明、有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱)與膽堿酯酶(cholinesterase,ChE)結(jié)合后的效應(yīng)標(biāo)志物的鑒定分析,為膽堿酯酶抑制劑的特征性鑒定及其毒理藥理研究提供了全新的分析技術(shù)手段。本研究論文共分為五章:第一章前言,對神經(jīng)性毒劑及其中毒機(jī)制、神經(jīng)性毒劑生物標(biāo)志物分析方法、神經(jīng)性毒劑抗毒藥研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹,并對重活化劑評價方法以及我所新型重活化劑研究成果進(jìn)行了評述。最后提出了本論文的研究意義與目的、研究內(nèi)容和研究創(chuàng)新點(diǎn)。第二章神經(jīng)性毒劑與膽堿酯酶加合物體外分析方法的建立,建立了四種典型神經(jīng)性毒劑(塔崩、沙林、梭曼、vx)與電鰩ache、人丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase,bche)加合物酶解后產(chǎn)生的三種含有活性加合位點(diǎn)的肽段(即活性肽、中毒肽和老化肽)的lc-ms/ms定量分析方法。運(yùn)用高分辨質(zhì)譜(lc-qtof-ms)技術(shù)確證了各特征性肽段的氨基酸序列和碎片特征,分析討論了其碎裂規(guī)律。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,本方法對未加合肽段的檢測限為0.2nm,定量限為0.5nm,選擇性、線性良好,精密度和準(zhǔn)確度符合方法學(xué)要求,基質(zhì)效應(yīng)小,穩(wěn)定性滿足實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作的需要。與傳統(tǒng)ellman酶活測定法比較,新建酶解-質(zhì)譜法不僅能準(zhǔn)確地表征nas中毒膽堿酯酶的抑制率(與ellman法測得的抑制率相同),而且可以在nas極低濃度暴露時測定nas特異性肽段(中毒肽、老化肽)。由于其可以精準(zhǔn)的測定膽堿酯酶所處的狀態(tài),所以比傳統(tǒng)酶活法具有更高的靈敏度和特異性。第三章神經(jīng)性毒劑中毒特征表征,應(yīng)用所建立的酶解-lc-ms/ms方法,系統(tǒng)分析了ache、bche暴露于四種神經(jīng)性毒劑(塔崩、沙林、梭曼、vx)后,三種特征性肽段(活性肽、中毒肽、老化肽)隨時間的變化趨勢,詳細(xì)描述了各nas的中毒、老化特征。結(jié)果顯示,生理條件下,梭曼暴露的ache,3分鐘即可完成中毒并全部老化;vx中毒后,老化肽在1小時后可被檢出;沙林中毒酶隨時間發(fā)生一定程度的老化;塔崩中毒酶則存在兩條老化途徑。在0℃低溫條件下,梭曼的中毒和老化過程明顯減緩,中毒肽可以持續(xù)地被檢出,且隨著ph值的升高,梭曼暴露的ache中毒及老化均減緩。四種神經(jīng)性毒劑暴露的bche,中毒速度相差不大。與暴露的ache相比,梭曼暴露的bche,中毒肽可以被持續(xù)地檢出;沙林暴露的bche,老化肽在1小時內(nèi)持續(xù)緩慢上升;vx暴露的bche20分鐘后可以檢測到老化肽。首次提出根據(jù)對na中毒膽堿酯酶特征性肽段質(zhì)譜定量數(shù)據(jù)計算na中毒速率常數(shù)、老化速率常數(shù)及老化半衰期的計算方法。第四章抗毒藥對神經(jīng)性毒劑中毒膽堿酯酶的防治效果評價,基于所建立的酶解-質(zhì)譜法,提出了一個全新的NAs重活化藥物的評價方法。本方法從分子水平觀測到活性肽、中毒肽、老化肽的變化關(guān)系并對其相對定量,通過純酶組、中毒組、給藥組活性肽的比較計算重活化率和相對膽堿酯酶活力,并根據(jù)中毒肽、老化肽的變化對重活化過程加以佐證。首次提出基于質(zhì)譜法的藥物重活化率、重活化劑EC50值計算公式,對經(jīng)典重活化劑評價結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。本方法避免了傳統(tǒng)Ellman法易受干擾、靈敏度低、特異性差的缺點(diǎn),給出藥物重活化作用最直接的證據(jù)。因此,本方法可以用作Ellman法的替代方法用于NAs重活化劑等抗毒藥物評價。對經(jīng)典肟類重活化劑及我所研發(fā)的新型重活化劑和復(fù)方藥物的評價結(jié)果表明,對于GB和VX中毒,各種藥物均顯示出較好的重活化作用。針對GA中毒,TMB-4、LuH、“85”急救方具有良好的重活化作用,L-1655、L-1978、MMB-4有一定的重活化效果;而對于梭曼中毒,因其中毒酶極易老化,目前可獲得的重活化劑對梭曼中毒救治均無效,但是L-1655、L-1978及“85”預(yù)防片表現(xiàn)出良好的預(yù)防效果。值得關(guān)注的是,LuH、TMB-4等重活化劑表現(xiàn)出加重GD中毒的現(xiàn)象。本章基于分析毒理學(xué)的思路,根據(jù)效應(yīng)標(biāo)志物的變化,分析討論了不同藥物的重活化作用機(jī)制。第五章其他化合物與膽堿酯酶加合物特異性肽段分析,將酶解-質(zhì)譜法應(yīng)用于其他類化合物與膽堿酯酶結(jié)合后效應(yīng)標(biāo)志物的鑒定分析,建立了檢測膽堿酯酶抑制劑吡啶斯的明、有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱(chlorpyrifos,CP)與AChE、BChE加合物的酶解-LC-MS/MS定量分析方法。證實(shí)了NAs預(yù)防藥吡啶斯的明通過與ChE活性絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生共價結(jié)合而發(fā)揮預(yù)防NAs中毒的作用。研究還發(fā)現(xiàn),CP與ChE于體外孵育后,發(fā)生加合作用的實(shí)際上是其氧化產(chǎn)物氧化毒死蜱(chlorpyrifos oxon,CPO)。本方法建立的CPO-AChE加合物定量分析方法可用于CP毒理機(jī)制研究,CPO-BChE加合物定量分析方法為臨床中毒確證、救治提供新的鑒定手段。這些實(shí)例表明,本課題所建立酶解-質(zhì)譜分析方法可廣泛應(yīng)用于膽堿酯酶抑制劑的特征性鑒定以及毒理藥理研究。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R917
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本文編號：1492819