本文關(guān)鍵詞： GLP-1 半衰期 分離純化 生物活性　出處：《上海醫(yī)藥工業(yè)研究院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：眾所周知,多肽類治療藥物易被體內(nèi)蛋白酶降解導(dǎo)致半衰期較短,臨床上往往通過增加給藥頻率或給藥劑量來實(shí)現(xiàn)治療效果,這無疑給患者造成了巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此,藥企和研發(fā)機(jī)構(gòu)不斷探索新型長效策略來延長多肽類藥物的半衰期。血清白蛋白結(jié)合序列(SABA序列),XTEN序列和PAS序列是國外最新報(bào)道可顯著延長多肽藥物半衰期的長效序列,但在國內(nèi)醫(yī)藥領(lǐng)域并沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)為研究對象,采用大腸桿菌重組表達(dá)的方式,將上述三種長效序列與GLP-1序列融合,考察融合蛋白的表達(dá)情況和生物活性,驗(yàn)證上述三種長效序列實(shí)施方法的可行性,為開發(fā)其他長效多肽藥物提供參考。文中就三個(gè)長效序列-SABA序列,XTEN序列和PAS序列分別與GLP-1序列進(jìn)行融合,設(shè)計(jì)了18個(gè)不同連接肽和不同組合方式的SABA-GLP-1融合序列、4個(gè)不同長度的XTEN-GLP-1融合序列、2個(gè)不同長度的PAS-GLP-1融合序列。上述構(gòu)建的24個(gè)新型長效融合序列均可成功在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。本研究通過優(yōu)化發(fā)酵誘導(dǎo)條件增加了融合蛋白的表達(dá)量,并對不同的融合蛋白建立了相應(yīng)的分離純化方法,得到了純度相對較高的融合蛋白產(chǎn)物。本研究還建立了GLP-1類化合物體外活性檢測方法,應(yīng)用該方法對長效藥物阿必魯肽和GLP-1(7-37)進(jìn)行了活性驗(yàn)證,同時(shí)對上述得到的所有長效GLP-1融合蛋白進(jìn)行了活性檢測和對比分析。結(jié)果表明:SABA-GLP-1融合蛋白均以包涵體形式表達(dá),后期需要對其進(jìn)行變性和復(fù)性,但復(fù)性后純化工藝相對簡單。不同連接肽連接的SABA-GLP-1融合蛋白在表達(dá)量和生物學(xué)活性方面也有較大差異,且該系列融合蛋白的體外生物學(xué)活性普遍不高,其中生物活性最高的S12融合蛋白的半數(shù)有效濃度為9.296 nmol/L;而XTEN-GLP-1和PAS-GLP-1融合蛋白均以可溶性形式表達(dá),且純化工藝復(fù)雜,但體外生物活性普遍較SABA-GLP-1融合蛋白高,其中活性較高的AE2和PAS1的半數(shù)有效濃度分別為5.068nmol/L和2.820 nmol/L。通過本研究表明,驗(yàn)證了利用大腸桿菌重組表達(dá)的方式制備上述三種長效融合蛋白方法的可行性。SABA序列,XTEN序列和PAS序列3個(gè)長效序列與多肽藥物融合后可在一定程度上保持生物活性,且不同長效序列的長度、Linker和組合方式的變化均對融合蛋白的生物活性產(chǎn)生顯著影響,后續(xù)可以通過優(yōu)化序列、Linker和不同組合方式進(jìn)一步提高其生物活性。
[Abstract]:It is well known that polypeptide treatment drugs are easy to be degraded by protease in vivo resulting in a shorter half-life, clinical treatment often by increasing the frequency or dosage of drugs to achieve therapeutic effect. This undoubtedly caused great suffering and economic burden to patients, therefore. Pharmaceutical companies and R & D institutions have been exploring new long-term strategies to prolong the half-life of polypeptide drugs. Serum albumin binding sequence (SABA). XTEN sequence and PAS sequence are the new long acting sequences which can prolong the half life of polypeptide drugs. However, there is no related literature in the field of medicine in China. In this study, glucagon like peptide-1 (GLP-1) was used as the research object, and Escherichia coli recombinant expression was used. The fusion of the three long-acting sequences with GLP-1 sequence was performed to investigate the expression and biological activity of the fusion protein and to verify the feasibility of the implementation of the three long-acting sequences. For the development of other long-acting polypeptide drugs, three long-acting sequences-SABA sequence XTEN sequence and PAS sequence were fused with GLP-1 sequence respectively. Eighteen SABA-GLP-1 fusion sequences with different binding peptides and different combinations were designed, and four XTEN-GLP-1 fusion sequences with different lengths were designed. Two PAS-GLP-1 fusion sequences of different lengths were constructed. The 24 novel fusion sequences were successfully expressed in Escherichia coli. In this study, the fusion was increased by optimizing the fermentation induction conditions. Protein expression. The different fusion proteins were separated and purified, and the relative high purity fusion protein products were obtained. In this study, the in vitro activity detection method of GLP-1 compounds was also established. This method was used to verify the activity of the long-acting drugs Abilutine and GLP-1 (7-37). At the same time, the activity of all the long-acting GLP-1 fusion proteins were detected and compared. The results showed that all of the fusion proteins were expressed in the form of inclusion body. The denaturation and renaturation were needed in the later stage, but the purification process after renaturation was relatively simple. The expression and biological activity of SABA-GLP-1 fusion protein with different ligation peptides were also different. The biological activity of S12 fusion protein was not high in vitro, and the median effective concentration of S12 fusion protein with the highest bioactivity was 9.296 nmol / L; However, both XTEN-GLP-1 and PAS-GLP-1 fusion proteins were expressed in soluble form, and the purification process was complicated, but the bioactivity in vitro was generally higher than that of SABA-GLP-1 fusion protein. The median effective concentrations of AE2 and PAS1 with high activity were 5.068 nmol / L and 2.820 nmol / L, respectively. The feasibility of preparing the three kinds of long-term fusion protein by E. coli recombinant expression was verified. The fusion of XTEN sequence and PAS sequence with polypeptide drugs can maintain biological activity to a certain extent and the length of different long-acting sequences. The changes of Linker and combination mode had a significant effect on the bioactivity of the fusion protein, which could be further improved by optimizing the sequence of linker and different combinations.
【學(xué)位授予單位】：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R915

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本文編號：1479337