本文關鍵詞： VPS33B TRAF3 Pf4 Cre 條件性基因敲除 血小板 CD40 CD40L 聚集 釋放 VPS33B 整合素αIIbβ3 outside-in ARC syndrome　出處：《華中科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分TRAF3和VPS33B血小板特異性基因敲除小鼠的繁殖和鑒定目的：制備腫瘤壞死因子受體相關因子3(TNF receptor associated factor 3, TRAF3)和空泡分選蛋白33同系物B (vacuolar protein sorting 33 homolog B, VPS33B)血小板特異性基因敲除小鼠,用于研究TRAF3和VPS33B在血小板功能中的作用。方法：通過實驗室已有的VPS33Bfl/fl基因打靶小鼠,TRAF3fl/fl基因打靶小鼠和Pf4 Cre小鼠,繁殖建立血小板的VPS33B和TRAF3特異性基因敲除小鼠和它的背景對照雜合子小鼠。并用PCR和western blotting方法檢測基因敲除小鼠的基因型和蛋白表達。結果：通過數(shù)代的繁殖,建立起穩(wěn)定可靠的TRAF3和VPS33B基因敲除模型,并在后續(xù)的實驗中,采取小鼠尾部PCR基因鑒定的方法,來檢測基因敲除小鼠和其雜合子基因對照,用于后續(xù)的實驗。結論：LoxP/Cre條件性基因敲除的方法,能克服基因敲除TRAF3和VPS33B引起的高的致死率,成功建立了研究TRAF3和VPS33B的條件性基因敲除小鼠模型。第二部分TRAF3基因敲除對血小板聚集和血栓形成的影響及其機制目的：CD40配體(CD40L)是腫瘤壞死因子TNF家族的成員分子。CD40L結合到CD40上,增強血小板激活和血栓形成。腫瘤壞死因子受體相關因子(TNFreceptor associated factor,TRAF)家族在CD40L-CD40相關信號轉導中扮演重要角色。目前,尚無報道研究TRAF家族成員TRAF3在血小板中的表達和功能。因此,本研究通過TRAF3特異性基因敲除小鼠研究TRAF3在血小板聚集和血栓形成中的作用及其機制。方法：采用血小板聚集儀觀察TRAF3-/-和wildtype小鼠對不同激動劑(collagen,thrombin,Par4)誘導的血小板聚集的影響,并檢測外源性添加CD40L對TRAF3-/-和wildtype小鼠血小板聚集的影響。采用流式細胞術和western blotting檢測TRAF3-/-和wildtype小鼠血小板上GPVI和整合素β3表達的變化,以及TRAF3-/-和wildtype小鼠止血和血栓形成時間的變化。結果：本研究發(fā)現(xiàn),在人和小鼠的血小板細胞中都可檢測到TRAF3的表達。作為血小板聚集和激活的負性調控因子,TRAF3敲除顯著增加凝血酶和膠原誘導的血小板聚集和釋放。血小板表面膠原受體GPVI.整合素αIIbβ3和TRAF2的表達都沒有被敲除TRAF3影響,說明在TRAF3敲除小鼠中增高的血小板激活并不是因為血小板受體表達的增高,也不是由于TRAF3基因敲除引起其它TRAF家族蛋白比如TRAF2蛋白表達的變化。在TRAF3敲除小鼠中,氯化鐵誘導的動脈血栓模型中的血栓形成時間顯著降低,但在小鼠斷尾流血時間實驗中,止血時間未發(fā)現(xiàn)受TRAF3基因敲除的影響。結論：TRAF3在血小板激活和血栓形成中具有負性調節(jié)作用。這一作用和TRAF家族其它的血小板功能蛋白不同,不依賴CD40L和CD40等血小板表面的受體實現(xiàn)。第三部分VPS33B基因敲除對血小板聚集和血栓形成的影響及其機制目的：整合素是一種異質二聚體膜蛋白,包含α和β亞基,在細胞粘附和轉移等各種生理功能中起著基礎性的重要作用,血小板整合素aIlbβ3在血小板功能和生理止血中可能有著重要的意義。調節(jié)血小板中整合素激活的分子機制目前尚不清楚。VPS33B是一種新的整合素結合蛋白。目前,尚無報道研究VPS33B在血小板中的表達和功能。因此,本研究通過VPS33B特異性基因敲除小鼠研究VPS33B在血小板聚集和血栓形成中的作用及其機制。方法：采用血小板聚集儀觀察VPS33B敲除小鼠對不同激動劑(collagen, thrombin)誘導的血小板聚集和釋放的影響,采用流式細胞術檢測VPS33B敲除小鼠和野生對照型小鼠血小板血小板整合素aIlbβ3等指標的含量以及結合率。采用熒光顯微鏡觀察VPS33B敲除和過量表達VPS33B對血小板在固化纖維蛋白原上的擴展等功能影響。觀察VPS33B敲除對斑塊回縮的影響。采用蛋白印跡法檢測VPS33B對血小板的主要信號通路蛋白及血小板“由外向內”信號轉導的影響。結果：我們發(fā)現(xiàn)VPS33B作為Secl/Munc18 (SM)蛋白家族的一員,能直接和整合素β亞基結合。在CHO細胞株中過量表達VPS33B能增強aIIbβ3 outside-in信號通路而不影響inside-out信號通路。我們構建了血小板特異性VPS33B敲除小鼠,從這些小鼠血液中分離的血小板具備正常的生理形態(tài),然而它們在纖維蛋白原上的擴展功能發(fā)生了改變,斑塊回縮功能也受到了影響。在VPS33B敲除小鼠中,在低濃度激動劑的刺激下,血小板的聚集和ATP的釋放功能都減弱。在VPS33B敲除小鼠中小鼠斷尾流血時間和血栓形成時間對比野生型小鼠都延長了。結論：我們的研究表明VPS33B是一種新的血小板整合素結合蛋白,它和β亞基結合。VPS33B通過影響整合素信號“外面向內”信號通路對血小板聚集和血栓形成產生了影響。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R965

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