發(fā)布時(shí)間：2018-01-30 09:00

  本文關(guān)鍵詞： 美洲大赤魷 CS 寡糖 抗腫瘤活性　出處：《山東大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：癌癥是導(dǎo)致全球人口死亡率升高的一個(gè)重要原因。癌癥之所以是人類久攻不下的難題與其自身的特性有很大的關(guān)系,其中最為棘手的特性是癌細(xì)胞能不斷遷移并侵入正常組織形成新的病灶。研究發(fā)現(xiàn),在這一過程中腫瘤細(xì)胞與相應(yīng)的正常組織在硫酸軟骨素(CS)的含量、組成、分子大小等方面有明顯差異。通常,這種CS組成和結(jié)構(gòu)上的差異與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這一特性使得CS的抗腫瘤活性成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。已有研究表明,CS分子的硫酸化模式、分子量大小等決定了CS的抗腫瘤活性。其中,CS-E硫酸化程度高、硫酸化模式復(fù)雜,且抗腫瘤活性強(qiáng)、抑瘤譜廣,成藥價(jià)值高。但是,目前商品化的CS-E主要來自一種名為太平洋褶皺魚(Todarodes Pacificus)的野生小型魷魚,價(jià)格昂貴,無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。隨著海洋污染加劇,這類CS-E的原料來源受到更加嚴(yán)重的威脅。更為重要的是,關(guān)于CS-E寡糖的抗腫瘤研究較少。本課題通過優(yōu)選CS原料,建立CS的分離、純化工藝,制備得到高純度富含[GlcAβ1-3GalNAc(4S,6S)] (E-unit)的新型CS,分析了其理化性質(zhì)。同時(shí),優(yōu)化了CS寡糖制備工藝,分離純化出富含E-unit的CS寡糖。此外,在分子和動(dòng)物個(gè)體水平系統(tǒng)分析了這一新型CS及其寡糖的抗腫瘤活性,探討了相關(guān)機(jī)理。具體如下：1.新型富含E-unit硫酸軟骨素(Novel E-unit-rich CS, NER-CS)多糖的制備與純度分析：以美洲大赤魷(Dosidicus Gigas)在食品加工過程中的軟骨廢棄物為原料,建立包括粉碎、脫水脫脂、酶解、除蛋白、醇沉、離子交換、脫鹽等操作流程的CS制備方法,制備得到新型CS。最終產(chǎn)品的產(chǎn)率達(dá)到16±2%。用商品化的硫酸軟骨素ABC酶、硫酸皮膚素酶、透明質(zhì)酸酶(來自于Streptomyces Hyalurolyticus)、以及實(shí)驗(yàn)室自有產(chǎn)權(quán)的rHCLase降解所得多糖,根據(jù)酶的底物專一性,確認(rèn)所制備的多糖為CS；通過咔唑反應(yīng)檢測(cè)樣品中新型CS含量,BCA蛋白定量法檢測(cè)樣品中蛋白含量。結(jié)果提示：樣品中新型CS含量達(dá)到97%以上,蛋白含量低于2%。2.新型CS多糖結(jié)構(gòu)的初步分析：參照葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)物,經(jīng)凝膠過濾HPLC分析,確定所制備的NER-CS多糖平均分子量約為623.2 kDa。再通過硫酸軟骨素ABC酶完全降解,結(jié)合HPLC分析二糖組成,發(fā)現(xiàn)NER-CS主要含有[GlcAβ1-3GalNAc] [GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、 [GlcAβ1-3GalNAc(6S)]、 E-unit,其中E-unit含量最高可達(dá)44.5%,同時(shí)[GlcAp 1-3GalNAc]、 [GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、 [GlcAβ1-3GalNAc(6S)]含量分別為7.1%、12.6%、35.8%,總硫酸化度為1.37。是一種新型高硫酸化CS。3NER-CS生物活性的初步分析：1)用Aglyco試劑盒檢測(cè)NER-CS的抗凝血活性,結(jié)果顯示：NER-CS抗FⅡa和抗FXa活性分別為20±2 U/mg和0.9±0.2 U/mg,是陽(yáng)性對(duì)照肝素抗FⅡa活性的10%左右,抗FXa活性的4%左右；2)利用乳腺癌4T1細(xì)胞試驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型,分析NER-CS在小鼠體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性,結(jié)果顯示：50、100和200μg NER-CS的抑瘤率分別為54.3±2.5%、75.1±3.5%、42.9±2.1%,同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照100μg肝素的抑瘤率為74.6±1.8%；3)用親和素修飾的CM5芯片固定生物素化NER-CS,分析NER-CS與五種生長(zhǎng)因子、三種選擇素的相互作用活性,結(jié)果顯示NER-CS與生長(zhǎng)因子HGF、bFGF相互作用活性較高,親和力常數(shù)分別為(3.47±1.73)x10-6、(5.39±2.92)x10-8。4. NER-CS寡糖的制備及其抗腫瘤活性分析：建立了一種制備CS寡糖的方法,采用高酶活的rHCLase,通過單因子實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了降解產(chǎn)生E-unit CS寡糖所需的酶用量與反應(yīng)時(shí)間,分離純化出不同聚合度的系列CS寡糖,分析了二糖組成,最后檢測(cè)了系列寡糖的抗腫瘤活性。結(jié)果表明120 mg NER-CS和口40μg的rHCLase在含05 M NaCl的PBS反應(yīng)液中,于37℃下反應(yīng)8h后可獲得聚合度為2-18的系列寡糖,100 μg的NER-CS八糖、十糖、十二糖、十四糖及多糖的抑瘤率分別為70.3±3.8%、74.0±2.6%、83.2±3.6%、74.8±4.6%和75.7±3.7%。綜上所述,本課題優(yōu)選成本低廉、產(chǎn)量大的美洲大赤魷軟骨為原料,建立了NER-CS的制備方法,得到了富含E-unit新型CS。NER-CS與生長(zhǎng)因子HGF、 bFGF存在強(qiáng)的相互作用,抗凝血活性低,具有強(qiáng)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性；進(jìn)一步通過優(yōu)化制備NER-CS寡糖方法,制備出不同聚合度系列寡糖,發(fā)現(xiàn)十二糖抑瘤率最高。本研究為研發(fā)CS類抗腫瘤轉(zhuǎn)移醫(yī)藥保健產(chǎn)品提供了有益參考。
[Abstract]:A new type of CS - E - rich CS - E , which is rich in E - unit , is prepared by using CS - oligosaccharide as raw material . A new type of CS was prepared . The yield of the final product reached 16 鹵 2 % . The results showed that the new CS content was more than 97 % and the content of protein was lower than 2 % . The tumor - inhibiting rates of 50 , 100 and 200 渭g NER - CS were 54.3 鹵 2.5 % , 75.1 鹵 3.5 % , 42.9 鹵 2.1 % , respectively . The preparation and anti - tumor activity of NER - CS oligosaccharides : A method for preparing CS - oligosaccharide was established . The enzyme dosage and reaction time required for degrading E - unit CS oligosaccharides were optimized by single - factor experiments . The results showed that the inhibitory rates of these oligosaccharides were 70.3 鹵 3.8 % , 74.0 鹵 2.6 % , 83.2 鹵 3.6 % , 74.8 鹵 4.6 % and 75.7 鹵 3.7 % , respectively .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96

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本文編號(hào)：1475838