本文關(guān)鍵詞： CXCR4/CXXL12生物軸 CXCR4拮抗劑E5 乳腺癌 白血病 血管生成 聯(lián)合用藥 納米銀 血管周炎癥 活性氧 細胞間連接 銀離子　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：乳腺癌細胞和急性髓系白血病(AML)細胞表面通常較高表達趨化因子受體CXCR4,而其配體CXCL12主要由腫瘤微環(huán)境和骨髓中的基質(zhì)細胞或成纖維細胞分泌。CXCL12能激活CXCR4信號傳導(dǎo)通路,為腫瘤細胞提供存活、增殖、粘附和趨化等信號,從而促進腫瘤生長和腫瘤細胞向其他器官的浸潤。CXCR4/CXCL12生物軸還可招募白血病細胞向骨髓歸巢,與骨髓中的基質(zhì)細胞粘附,獲得生存信號并形成微小殘留病灶。上述過程為乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移或白血病的復(fù)發(fā)與耐藥埋下了隱患。此外,CXCL12還能吸引內(nèi)皮祖細胞向腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)移,促進血管生成,為腫瘤的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。因此阻斷CXCR4/CXCL12的相互作用可以抑制腫瘤細胞生長、粘附和浸潤行為,從而有效提高化療藥對腫瘤細胞的治療功效。在前期研究過程中,我們根據(jù)CXCR4結(jié)構(gòu)和序列的特征設(shè)計得到了小分子多肽E5,并在細胞和動物模型上證明了E5能有效抑制AML細胞對CXCL12活化作用的響應(yīng)。本研究擬在細胞和乳腺癌小鼠模型及AML小鼠模型上,將E5與化療藥聯(lián)合使用,評價E5對化療藥治療功效的作用并研究其作用機理：同時,在健康小鼠模型上研究E5的藥代動力學(xué)。方法：以小鼠乳腺癌細胞4T1、小鼠骨髓基質(zhì)細胞MS-5和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC為模型,通過流式細胞術(shù)檢測E5與乳腺癌細胞的結(jié)合情況；利用細胞活性檢測試劑(CCK-8)、western blot和Annexin V-PI雙染方法檢測E5對4T1細胞的毒性；通過transwell細胞遷移小室以及細胞共培養(yǎng)的方法研究E5對細胞向基質(zhì)細胞遷移和粘附的影響；用western blot方法檢測E5對CXCR4下游Akt和Erk信號通路的作用；利用CCK-8方法檢測E5聯(lián)合多種化療藥對于MS-5細胞共培養(yǎng)的4T1細胞活性的影響；在乳腺癌小鼠模型上,將E5與多種化療藥聯(lián)合應(yīng)用,對荷瘤小鼠進行治療,通過監(jiān)測小鼠腫瘤尺寸和統(tǒng)計小鼠生存期來評價治療效果。進一步通過用western blot檢測小鼠腫瘤內(nèi)與CXCR4下游信號通路相關(guān)的蛋白以及與血管生成相關(guān)蛋白的水平,探討E5的作用機理；在AML小鼠模型上,分別在注射E5前后收集小鼠外周血并用流式細胞術(shù)檢測E5對AML細胞的動員作用。將E5與長春新堿或環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療,通過檢測小鼠體重和生存期以及骨髓、脾臟中白血病細胞比例評價治療效果；對健康小鼠皮下注射FITC標記的E5,通過熒光成像和檢測小鼠血液中的熒光強度來評價E5在體內(nèi)的代謝。結(jié)果：(1)E5與高表達CXCR4的4T1和HUVEC細胞均有較強的結(jié)合,而與低表達CXCR4的MS-5細胞結(jié)合較弱。(2)當濃度高于25 μM時,E5能抑制4T1細胞的活性,并誘導(dǎo)細胞的凋亡。(3)培養(yǎng)基中添加的CXCL12可以誘導(dǎo)4T1和HUVEC細胞的遷移；而使用E5對兩種細胞進行處理,則可有效抑制CXCL12誘導(dǎo)的細胞遷移；此外,E5還能有效抑制由MS-5細胞制備的條件培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的4T1細胞的遷移和粘附。(4)E5能有效拮抗CXCR4/CXCL12生物軸介導(dǎo)的信號通路,抑制CXCR4下游Akt和Erk蛋白的磷酸化。(5)當E5分別與紫杉醇、順鉑、阿霉素、或長春新堿聯(lián)合作用于4T1細胞時,E5能提高細胞對化療藥的敏感性,有效增加化療藥誘導(dǎo)的4T1細胞的死亡。(6)將E5與環(huán)磷酰胺或阿霉素聯(lián)合治療乳腺癌小鼠時,與單純化療藥治療相比,E5聯(lián)合化療藥能明顯抑制乳腺癌小鼠的腫瘤生長,延長荷瘤小鼠的生存期,從而提高化療藥對荷瘤小鼠的治療效果。(7)E5能明顯降低小鼠腫瘤部位CD31的表達水平,抑制腫瘤內(nèi)新生血管的生成,同時E5有效抑制腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的CXCR4下游Akt和Erk蛋白的磷酸化。(8)E5能有效動員白血病小鼠體內(nèi)白血病細胞至外周循環(huán)中,減緩白血病小鼠的癥狀。(9)E5聯(lián)合長春新堿或環(huán)磷酰胺顯著減少了白血病細胞向骨髓、脾臟和脾臟中的浸潤,延長了AML小鼠的生存期。(10)單次皮下注射的E5主要通過小鼠肝臟代謝出體外,在注射后2 h達到最高藥物濃度,半衰期約為10 h。結(jié)論：E5通過拮抗CXCR4/CXCL12生物軸而阻斷乳腺癌細胞、AML細胞與基質(zhì)細胞的相互作用,有效抑制了乳腺癌細胞和AML細胞趨向CXCL12的遷移和粘附,從而提高了多種化療藥對乳腺癌小鼠和AML小鼠的治療效果。此外,E5還能通過阻斷血管內(nèi)皮細胞向腫瘤組織中的遷移而抑制血管的生成。因此,E5在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以及乳腺癌和AML的治療中具有應(yīng)用價值。目的：納米銀(AgNPs)具有顯著優(yōu)于銀離子化合物的抗菌性能,因此在家用產(chǎn)品、電子、食品包裝、醫(yī)用器械等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用探索。但是,隨著日常生活和醫(yī)療中接觸含AgNPs材料機會的增加,AgNPs對健康、環(huán)境和安全的影響正在引起各國政府和國際組織機構(gòu)以及學(xué)術(shù)界的密切關(guān)注。大量研究已經(jīng)表明,AgNPs對不同種類的細胞均有明確的細胞毒性和遺傳毒性,主要表現(xiàn)在抑制細胞生長、增加細胞膜通透性、誘導(dǎo)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),影響炎癥因子和細胞因子的分泌、改變細胞間連接、損傷DNA等。AgNPs可以通過不同途徑進入生物體,且主要集中在模型動物的肝、肺、腎、脾等靶器官中,與此同時,AgNPs可以在復(fù)雜的生物環(huán)境中持續(xù)釋放Ag+。但是,目前對于兩者介導(dǎo)的毒性作用機制和貢獻比例迄今仍不清楚。靜脈暴露AgNPs可以模擬醫(yī)療人員或病人傷口接觸含AgNPs醫(yī)療器械時經(jīng)血液途徑暴露的過程。本研究采用尾靜脈注射暴露方式研究比較AgNPs和硝酸銀(AgNO3)的全身毒性,并探討兩者細胞毒性機制的差異。方法：選擇檸檬酸包被的不同尺寸的AgNPs(10、75和110 nm)和AgNO3為研究材料,在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株(HUVEC)上,通過透射電鏡(TEM)觀察和動態(tài)光散射(DLS)檢測,研究AgNPs在不同介質(zhì)中的分散穩(wěn)定性、顆粒尺寸分布以及表面電荷狀態(tài)；采用CCK-8法研究AgNPs對細胞增殖的影響,采用Hoechst/PI染色方法檢測AgNPs對細胞凋亡的影響；采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測細胞對AgNPs或AgNO3的攝取,并通過TEM觀察AgNPs在細胞中的定位；利用流式細胞術(shù)分析AgNPs對細胞內(nèi)ROS水平的影響；并利用激光共聚焦顯微觀察細胞連接蛋白的變化和細胞骨架微絲蛋白的重排。在體內(nèi)實驗中,經(jīng)尾靜脈單次或多次注射AgNPs至小鼠體內(nèi)后,通過TEM觀察AgNPs在小鼠肝臟中的定位；通過組織切片觀察小鼠各組織器官及其血管周圍的病理改變,以及檢測血清中肝、腎功的主要血生化指標和補體C3的變化,以探究AgNPs對小鼠的器官毒性。結(jié)果：(1)三種尺寸的AgNPs都呈顆粒狀,大小均勻,平均尺寸分別為11 ±1 nm、 76 ±6 nm和107±8nm；表面帶負電荷,在水中的水合粒徑分別為9.8±3.2nm、 72.0 ± 0.9 nm和99.3±1.7 nm,能分散于水和含血清培養(yǎng)基中。(2)AgNPs可以通過內(nèi)吞途徑進入HUVEC細胞內(nèi),并定位在囊泡或自噬體中；而AgNO3進入細胞的量很少。 (3)AgNPs能明顯抑制細胞的增殖,且具有明顯的濃度依賴效應(yīng),在20μg/mL濃度下,細胞的抑制率分別為6.7%、12.8%和47.3%,而AgNO3在該濃度下,細胞存活率為1.2%。(4)三種尺寸的AgNPs都能明顯引起HUVEC細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),且具有明顯的濃度依賴性;此外AgNPs減少了HUVEC細胞間鈣黏蛋白的作用并介導(dǎo)了細胞骨架的重排,由此破壞了血管內(nèi)皮細胞間連接；抗氧化劑乙酰半胱氨酸(NAC)能明顯抑制AgNPs誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS水平的升高和降低AgNPs對細胞間鈣黏蛋白的影響,提高細胞的生存率；低劑量的AgNO3沒有引起胞內(nèi)ROS水平的升高和細胞間連接的變化,而高濃度的AgNO3直接導(dǎo)致了細胞死亡。(5)尾靜脈注射的AgNPs主要定位在小鼠肝臟組織中的血管周圍；多次尾靜脈注射AgNPs能引起小鼠肝、腎、肺等靶器官血管周圍明顯的炎癥反應(yīng),包括大量的單核細胞和少量的中性粒細胞在組織血管周圍的聚集,顯著降低補體C3的水平,引起補體系統(tǒng)的激活；AgNPs引起的肝臟炎癥程度達到中等級別；而靜脈注射的AgNO3對小鼠的肝、腎、肺影響較小,沒有引起明顯的病理改變。結(jié)論：AgNPs經(jīng)靜脈血液暴露途徑進入健康小鼠體內(nèi)后,可通過內(nèi)吞方式進入血管內(nèi)皮細胞,誘導(dǎo)細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS,由此破壞細胞間連接,導(dǎo)致血管內(nèi)皮泄露并招募炎癥細胞向破損的血管組織周圍聚集,從而介導(dǎo)小鼠肝、腎、肺等靶器官血管周炎癥反應(yīng)；而AgNO3進入的細胞的量很少,通過非ROS途徑介導(dǎo)細胞的壞死。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
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本文編號：1474361