本文關(guān)鍵詞： CXCR4/CXXL12生物軸 CXCR4拮抗劑E5 乳腺癌 白血病 血管生成 聯(lián)合用藥 納米銀 血管周炎癥 活性氧 細(xì)胞間連接 銀離子　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：乳腺癌細(xì)胞和急性髓系白血病(AML)細(xì)胞表面通常較高表達(dá)趨化因子受體CXCR4,而其配體CXCL12主要由腫瘤微環(huán)境和骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞分泌。CXCL12能激活CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)通路,為腫瘤細(xì)胞提供存活、增殖、粘附和趨化等信號(hào),從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞向其他器官的浸潤(rùn)。CXCR4/CXCL12生物軸還可招募白血病細(xì)胞向骨髓歸巢,與骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞粘附,獲得生存信號(hào)并形成微小殘留病灶。上述過(guò)程為乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移或白血病的復(fù)發(fā)與耐藥埋下了隱患。此外,CXCL12還能吸引內(nèi)皮祖細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)移,促進(jìn)血管生成,為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此阻斷CXCR4/CXCL12的相互作用可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附和浸潤(rùn)行為,從而有效提高化療藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的治療功效。在前期研究過(guò)程中,我們根據(jù)CXCR4結(jié)構(gòu)和序列的特征設(shè)計(jì)得到了小分子多肽E5,并在細(xì)胞和動(dòng)物模型上證明了E5能有效抑制AML細(xì)胞對(duì)CXCL12活化作用的響應(yīng)。本研究擬在細(xì)胞和乳腺癌小鼠模型及AML小鼠模型上,將E5與化療藥聯(lián)合使用,評(píng)價(jià)E5對(duì)化療藥治療功效的作用并研究其作用機(jī)理：同時(shí),在健康小鼠模型上研究E5的藥代動(dòng)力學(xué)。方法：以小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1、小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞MS-5和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為模型,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)E5與乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合情況；利用細(xì)胞活性檢測(cè)試劑(CCK-8)、western blot和Annexin V-PI雙染方法檢測(cè)E5對(duì)4T1細(xì)胞的毒性；通過(guò)transwell細(xì)胞遷移小室以及細(xì)胞共培養(yǎng)的方法研究E5對(duì)細(xì)胞向基質(zhì)細(xì)胞遷移和粘附的影響；用western blot方法檢測(cè)E5對(duì)CXCR4下游Akt和Erk信號(hào)通路的作用；利用CCK-8方法檢測(cè)E5聯(lián)合多種化療藥對(duì)于MS-5細(xì)胞共培養(yǎng)的4T1細(xì)胞活性的影響；在乳腺癌小鼠模型上,將E5與多種化療藥聯(lián)合應(yīng)用,對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行治療,通過(guò)監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤尺寸和統(tǒng)計(jì)小鼠生存期來(lái)評(píng)價(jià)治療效果。進(jìn)一步通過(guò)用western blot檢測(cè)小鼠腫瘤內(nèi)與CXCR4下游信號(hào)通路相關(guān)的蛋白以及與血管生成相關(guān)蛋白的水平,探討E5的作用機(jī)理；在AML小鼠模型上,分別在注射E5前后收集小鼠外周血并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)E5對(duì)AML細(xì)胞的動(dòng)員作用。將E5與長(zhǎng)春新堿或環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療,通過(guò)檢測(cè)小鼠體重和生存期以及骨髓、脾臟中白血病細(xì)胞比例評(píng)價(jià)治療效果；對(duì)健康小鼠皮下注射FITC標(biāo)記的E5,通過(guò)熒光成像和檢測(cè)小鼠血液中的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)E5在體內(nèi)的代謝。結(jié)果：(1)E5與高表達(dá)CXCR4的4T1和HUVEC細(xì)胞均有較強(qiáng)的結(jié)合,而與低表達(dá)CXCR4的MS-5細(xì)胞結(jié)合較弱。(2)當(dāng)濃度高于25 μM時(shí),E5能抑制4T1細(xì)胞的活性,并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。(3)培養(yǎng)基中添加的CXCL12可以誘導(dǎo)4T1和HUVEC細(xì)胞的遷移；而使用E5對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行處理,則可有效抑制CXCL12誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移；此外,E5還能有效抑制由MS-5細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞的遷移和粘附。(4)E5能有效拮抗CXCR4/CXCL12生物軸介導(dǎo)的信號(hào)通路,抑制CXCR4下游Akt和Erk蛋白的磷酸化。(5)當(dāng)E5分別與紫杉醇、順鉑、阿霉素、或長(zhǎng)春新堿聯(lián)合作用于4T1細(xì)胞時(shí),E5能提高細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性,有效增加化療藥誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞的死亡。(6)將E5與環(huán)磷酰胺或阿霉素聯(lián)合治療乳腺癌小鼠時(shí),與單純化療藥治療相比,E5聯(lián)合化療藥能明顯抑制乳腺癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng),延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期,從而提高化療藥對(duì)荷瘤小鼠的治療效果。(7)E5能明顯降低小鼠腫瘤部位CD31的表達(dá)水平,抑制腫瘤內(nèi)新生血管的生成,同時(shí)E5有效抑制腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的CXCR4下游Akt和Erk蛋白的磷酸化。(8)E5能有效動(dòng)員白血病小鼠體內(nèi)白血病細(xì)胞至外周循環(huán)中,減緩白血病小鼠的癥狀。(9)E5聯(lián)合長(zhǎng)春新堿或環(huán)磷酰胺顯著減少了白血病細(xì)胞向骨髓、脾臟和脾臟中的浸潤(rùn),延長(zhǎng)了AML小鼠的生存期。(10)單次皮下注射的E5主要通過(guò)小鼠肝臟代謝出體外,在注射后2 h達(dá)到最高藥物濃度,半衰期約為10 h。結(jié)論：E5通過(guò)拮抗CXCR4/CXCL12生物軸而阻斷乳腺癌細(xì)胞、AML細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用,有效抑制了乳腺癌細(xì)胞和AML細(xì)胞趨向CXCL12的遷移和粘附,從而提高了多種化療藥對(duì)乳腺癌小鼠和AML小鼠的治療效果。此外,E5還能通過(guò)阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織中的遷移而抑制血管的生成。因此,E5在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以及乳腺癌和AML的治療中具有應(yīng)用價(jià)值。目的：納米銀(AgNPs)具有顯著優(yōu)于銀離子化合物的抗菌性能,因此在家用產(chǎn)品、電子、食品包裝、醫(yī)用器械等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用探索。但是,隨著日常生活和醫(yī)療中接觸含AgNPs材料機(jī)會(huì)的增加,AgNPs對(duì)健康、環(huán)境和安全的影響正在引起各國(guó)政府和國(guó)際組織機(jī)構(gòu)以及學(xué)術(shù)界的密切關(guān)注。大量研究已經(jīng)表明,AgNPs對(duì)不同種類的細(xì)胞均有明確的細(xì)胞毒性和遺傳毒性,主要表現(xiàn)在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增加細(xì)胞膜通透性、誘導(dǎo)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),影響炎癥因子和細(xì)胞因子的分泌、改變細(xì)胞間連接、損傷DNA等。AgNPs可以通過(guò)不同途徑進(jìn)入生物體,且主要集中在模型動(dòng)物的肝、肺、腎、脾等靶器官中,與此同時(shí),AgNPs可以在復(fù)雜的生物環(huán)境中持續(xù)釋放Ag+。但是,目前對(duì)于兩者介導(dǎo)的毒性作用機(jī)制和貢獻(xiàn)比例迄今仍不清楚。靜脈暴露AgNPs可以模擬醫(yī)療人員或病人傷口接觸含AgNPs醫(yī)療器械時(shí)經(jīng)血液途徑暴露的過(guò)程。本研究采用尾靜脈注射暴露方式研究比較AgNPs和硝酸銀(AgNO3)的全身毒性,并探討兩者細(xì)胞毒性機(jī)制的差異。方法：選擇檸檬酸包被的不同尺寸的AgNPs(10、75和110 nm)和AgNO3為研究材料,在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)上,通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè),研究AgNPs在不同介質(zhì)中的分散穩(wěn)定性、顆粒尺寸分布以及表面電荷狀態(tài)；采用CCK-8法研究AgNPs對(duì)細(xì)胞增殖的影響,采用Hoechst/PI染色方法檢測(cè)AgNPs對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)AgNPs或AgNO3的攝取,并通過(guò)TEM觀察AgNPs在細(xì)胞中的定位；利用流式細(xì)胞術(shù)分析AgNPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響；并利用激光共聚焦顯微觀察細(xì)胞連接蛋白的變化和細(xì)胞骨架微絲蛋白的重排。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)尾靜脈單次或多次注射AgNPs至小鼠體內(nèi)后,通過(guò)TEM觀察AgNPs在小鼠肝臟中的定位；通過(guò)組織切片觀察小鼠各組織器官及其血管周圍的病理改變,以及檢測(cè)血清中肝、腎功的主要血生化指標(biāo)和補(bǔ)體C3的變化,以探究AgNPs對(duì)小鼠的器官毒性。結(jié)果：(1)三種尺寸的AgNPs都呈顆粒狀,大小均勻,平均尺寸分別為11 ±1 nm、 76 ±6 nm和107±8nm；表面帶負(fù)電荷,在水中的水合粒徑分別為9.8±3.2nm、 72.0 ± 0.9 nm和99.3±1.7 nm,能分散于水和含血清培養(yǎng)基中。(2)AgNPs可以通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入HUVEC細(xì)胞內(nèi),并定位在囊泡或自噬體中；而AgNO3進(jìn)入細(xì)胞的量很少。 (3)AgNPs能明顯抑制細(xì)胞的增殖,且具有明顯的濃度依賴效應(yīng),在20μg/mL濃度下,細(xì)胞的抑制率分別為6.7%、12.8%和47.3%,而AgNO3在該濃度下,細(xì)胞存活率為1.2%。(4)三種尺寸的AgNPs都能明顯引起HUVEC細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),且具有明顯的濃度依賴性;此外AgNPs減少了HUVEC細(xì)胞間鈣黏蛋白的作用并介導(dǎo)了細(xì)胞骨架的重排,由此破壞了血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接；抗氧化劑乙酰半胱氨酸(NAC)能明顯抑制AgNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高和降低AgNPs對(duì)細(xì)胞間鈣黏蛋白的影響,提高細(xì)胞的生存率；低劑量的AgNO3沒(méi)有引起胞內(nèi)ROS水平的升高和細(xì)胞間連接的變化,而高濃度的AgNO3直接導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。(5)尾靜脈注射的AgNPs主要定位在小鼠肝臟組織中的血管周圍；多次尾靜脈注射AgNPs能引起小鼠肝、腎、肺等靶器官血管周圍明顯的炎癥反應(yīng),包括大量的單核細(xì)胞和少量的中性粒細(xì)胞在組織血管周圍的聚集,顯著降低補(bǔ)體C3的水平,引起補(bǔ)體系統(tǒng)的激活；AgNPs引起的肝臟炎癥程度達(dá)到中等級(jí)別；而靜脈注射的AgNO3對(duì)小鼠的肝、腎、肺影響較小,沒(méi)有引起明顯的病理改變。結(jié)論：AgNPs經(jīng)靜脈血液暴露途徑進(jìn)入健康小鼠體內(nèi)后,可通過(guò)內(nèi)吞方式進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS,由此破壞細(xì)胞間連接,導(dǎo)致血管內(nèi)皮泄露并招募炎癥細(xì)胞向破損的血管組織周圍聚集,從而介導(dǎo)小鼠肝、腎、肺等靶器官血管周炎癥反應(yīng)；而AgNO3進(jìn)入的細(xì)胞的量很少,通過(guò)非ROS途徑介導(dǎo)細(xì)胞的壞死。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
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本文編號(hào)：1474361