本文關(guān)鍵詞： 深海來源無活性菌株 雜色曲霉 抗性導(dǎo)入 活性產(chǎn)物 DMSO 超聲　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在特殊生境下提取的微生物活性產(chǎn)物研究中,在篩選得到能夠產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的微生物過程中,僅有少量的微生物菌株能產(chǎn)生相應(yīng)的活性,并可以直接應(yīng)用于次級代謝產(chǎn)物的研究,而絕大多數(shù)菌株則在相應(yīng)的篩選模型中沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的活性。如何改造這些無活性菌株的次級代謝功能,進(jìn)而使其有效地轉(zhuǎn)化為活性菌株,并產(chǎn)生相應(yīng)的活性次級代謝產(chǎn)物,是本課題所需要研究的重點。核糖體工程及其相關(guān)的抗生素抗性篩選技術(shù)已被成功地應(yīng)用在了調(diào)控原核微生物領(lǐng)域微生物的次級代謝功能改造上,而通過氨基糖苷類抗生素抗性篩選將無活性真菌野生株轉(zhuǎn)化成活性突變株,僅在本課題組前期工作中,探索性地應(yīng)用在特殊生境的潮間帶真菌產(chǎn)紫青霉G59上,本研究在此基礎(chǔ)之上,將抗生素抗性導(dǎo)入真菌細(xì)胞的技術(shù)應(yīng)用到另一株深海來源的無活性野生真菌,使其發(fā)生活性化轉(zhuǎn)化,得到穩(wěn)定的具有活性的抗性突變株,通過抗性驗證,證明其抗性被穩(wěn)定的導(dǎo)入,再通過發(fā)酵分離得到新產(chǎn)活性化合物并驗證之,最終闡明了突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的研究。本論文以從采集于174.2130°E,24.3444°S(南太平洋斐濟周邊大洋),水深800米處海泥中提取的無活性真菌ZBY-3,經(jīng)分類學(xué)研究鑒定該菌株為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)。采用DMSO與超聲介導(dǎo)下的不同濃度的新霉素抗性篩選方法獲取突變株,并對突變株進(jìn)行了抗細(xì)菌、抗腫瘤活性篩選。在此基礎(chǔ)上對其中1株活性突變株進(jìn)行了新產(chǎn)活性產(chǎn)物的研究。分離得到雜色曲霉ZBY-3,采用MTT法,以人白血病K562細(xì)胞為受試細(xì)胞,經(jīng)初篩和復(fù)篩,在100μg/m L樣品濃度下沒有抗腫瘤作用。這一株無活性菌株則為探索二次開發(fā)無活性菌株的相關(guān)研究提供了有效的原始菌株。采用超聲、DMSO不同的介導(dǎo)方法,對含有不同濃度新霉素的孢子懸液進(jìn)行處理,結(jié)果證實DMSO介導(dǎo)新霉素的抗性篩選方法能獲取突變株。通過對菌懸液處理時間、DMSO體積濃度比、新霉素濃度等因素進(jìn)行考察,進(jìn)一步完善與補充了DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性導(dǎo)入無活性真菌篩選方法,運用氨基糖苷類抗生素對真菌進(jìn)行抗性篩選,從而將無活性真菌轉(zhuǎn)化為活性菌株資源。通過建立的DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性篩選方法對無活性深海來源真菌雜色曲霉ZBY-3進(jìn)行處理,共分離得到了33株的在形態(tài)學(xué)上有差異的抗性突變株,其中的12株的發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物在100μg/m L時對人慢性髓源性白血病細(xì)胞K562細(xì)胞有大于30%的抑制增殖生長的活性(占總的抗性突變株數(shù)目的 36.4%),并且通過TLC薄層分析,可以看出活性突變株的次級代謝產(chǎn)物中,生成了原始菌株ZBY-3所不能代謝產(chǎn)生的物質(zhì),這些結(jié)果表明,利用本章節(jié)所表述的研究方法,通過DMSO介導(dǎo)下的新霉素導(dǎo)入無活性深海真菌,確實能夠改造原始菌株,并獲得新的活性次級代謝產(chǎn)物,從而拓展可供研究活性產(chǎn)物的菌株來源。另一方面,通過建立的超聲介導(dǎo)下的高濃度新霉素抗性篩選方法對無活性深海來源真菌雜色曲霉ZBY-3進(jìn)行處理,共分離得到了30株的在形態(tài)學(xué)上有差異的抗性突變株,通過一系列的抗腫瘤細(xì)胞活性測試、抗菌活性測試,17株抗性突變株的次級代謝產(chǎn)物在100μg/m L濃度下對K562細(xì)胞抑制率超過30%,活性轉(zhuǎn)化率達(dá)56.7%,其中的10株次級代謝產(chǎn)物對K562細(xì)胞的抑制率穩(wěn)定大于50%,另外的7株次級代謝產(chǎn)物對K562細(xì)胞的抑制率穩(wěn)定地介于30%到50%;6株抗性突變株的次級代謝產(chǎn)物在紙片法測量抑菌活性的實驗中,750μg/紙片的濃度下,有6株抗性突變株對大腸埃希菌ATCC#174;25922有抑菌活性,活性轉(zhuǎn)化率達(dá)到20%。結(jié)合TLC與HPLC-PDAD-UV對比圖,以及結(jié)合抗性突變株的活性強弱,基于產(chǎn)物的豐富程度,我們選擇了200-2003h 1-2作為下一步次級代謝產(chǎn)物研究的對象。針對活性突變株200-200 3h 1-2,我們開展了抗性驗證實驗,在同樣條件下對原始菌株ZBY-3和目標(biāo)菌株200-200 3h 1-2同時進(jìn)行抗性試驗,從而驗證了200-200 3h1-2的新霉素抗性被成功導(dǎo)入。進(jìn)而對抗性突變株進(jìn)行大量發(fā)酵,并通過活性追蹤的方法,將抗性突變株的次級代謝產(chǎn)物與原始菌株進(jìn)行比對,分離并且純化原始菌株所不產(chǎn)的,突變株代謝產(chǎn)物中所新產(chǎn)的6個單體化合物:Cyclo(D-Pro-D-Phe)(1)、Cyclo-(D-tyrosyl-D-proline)(2)、Phenethyl 5-oxoprolinate(3)、Cyclo(L-Ile-L-Pro)(4)、Cyclo(L-Leu-L-Pro)(5)、3β,5α,9α-Trihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-one(6),其中化合物2是新天然產(chǎn)物,化合物3為新化合物。這些產(chǎn)物在100μg/m L對K562,HL60,BGC-823,Hela細(xì)胞均有或弱或強的抗腫瘤活性。其中化合物1,2,6對K562細(xì)胞的IC50值分別為399.5μM(1),303.7μM(2),221.0μM(6),化合物1,2,3,6對HL-60細(xì)胞的IC50值分別為225.6μM(1),254.7μM(2),215.1μM(3),89.1μM(6),化合物1,2,6對BGC-823細(xì)胞的IC50值分別為242.2μM(1),328.7μM(2),177.7μM(6),化合物3,6對Hela細(xì)胞的IC50值分別為194.5μM(3),224.3μM(6),并且通過HPLC-MS驗證了這六個化合物為原始菌株所不生產(chǎn),而是抗性突變株所新生產(chǎn)的�？偠灾�,在本研究中,以深海來源無活性野生菌株為原始菌株,在通過DMSO與超聲介導(dǎo)下的新霉素抗性導(dǎo)入真菌的基礎(chǔ)上,通過體外篩選模型的篩選,實現(xiàn)了無活性菌株的活性化轉(zhuǎn)化,并獲得了活性突變株,并闡明了其中一株活性突變株200-2003h 1-2的部分突變株新產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物。這一系列研究表明通過對無活性野生真菌進(jìn)行抗性導(dǎo)入,獲得活性抗性突變株,并對其大量發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)新的活性化合物乃至新的活性天然產(chǎn)物。這一研究建立了一條完整的途徑,能夠?qū)o活性野生菌株轉(zhuǎn)化為有活性菌株,使得人們不再將目光局限于有活性的野生菌株,有效地開拓了有活性的藥源微生物菌株新資源,是具有實際可行性和應(yīng)用價值的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R915

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1467508