發(fā)布時(shí)間：2018-01-25 13:50

  本文關(guān)鍵詞： 睪酮 運(yùn)動(dòng)行為 多巴胺 囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2 利血平　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為(Coordinated motor behaviors)是指在完成某種活動(dòng)時(shí),運(yùn)動(dòng)器官有組織的和諧動(dòng)作。在機(jī)體衰老過(guò)程中,發(fā)生與年齡相關(guān)的運(yùn)動(dòng)行為缺陷,包括:感覺(jué)遲鈍、運(yùn)動(dòng)發(fā)起緩慢、肌力減退和協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為缺陷,是行為衰老的標(biāo)志之一。年齡相關(guān)運(yùn)動(dòng)行為缺陷與黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能體系在正常衰老過(guò)程中出現(xiàn)退行性改變密切相關(guān),黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能體系退行性改變導(dǎo)致多巴胺(Dopamine,DA)神經(jīng)遞質(zhì)的儲(chǔ)存、釋放和代謝紊亂,引起老年大鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)行為、肌力和協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為缺陷。很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)雄性甾體激素(Anabolic androgenic steroids,AAS)能夠影響機(jī)體行為。丙酸睪酮(Testosterone propionate,TP)替代后增強(qiáng)去勢(shì)大鼠的抗焦慮行為,增加去勢(shì)大鼠和老年大鼠靜止聞嗅、探索行為、運(yùn)動(dòng)行為和修飾行為,恢復(fù)去勢(shì)大鼠交配行為,維持老年大鼠的性功能,出生后早期皮下注射TP可改變大鼠青春期的運(yùn)動(dòng)行為。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中雄激素有多種生物學(xué)效應(yīng),TP替代后增加正常雄性大鼠腦部多巴胺能神經(jīng)元的功能活動(dòng),逆轉(zhuǎn)去勢(shì)導(dǎo)致的中樞多巴胺能系統(tǒng)功能降低,改善老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能體系的功能;TP替代后還能夠增加正常大鼠和去勢(shì)大鼠腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量。黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能系統(tǒng)內(nèi),囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2(Vesicular monoamine transporter type 2,VMAT2)是位于單胺能神經(jīng)元突觸囊泡膜上的一種跨膜糖蛋白,主要介導(dǎo)突觸囊泡對(duì)DA的儲(chǔ)存和釋放,減少胞漿內(nèi)游離的DA氧化代謝對(duì)神經(jīng)元的損傷。腦內(nèi)VMAT2的含量能夠間接反映腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的功能狀態(tài),有研究表明各種原因引起的VMAT2功能異常,都會(huì)影響到腦內(nèi)DA的儲(chǔ)存和釋放,最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元退行性變。以往研究顯示,衰老時(shí)黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能體系VMAT2表達(dá)降低。另有流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),與衰老相關(guān)的多巴胺能系統(tǒng)紊亂疾病(如帕金森病)多發(fā)于老年男性,而老年男性血清睪酮水平顯著降低。我們推測(cè),衰老過(guò)程中VMAT2表達(dá)的下降與雄激素水平下降有關(guān)。因此,本研究通過(guò)網(wǎng)格棒下降實(shí)驗(yàn)(Descending a wire mesh pole)、楔形板行走實(shí)驗(yàn)(Tapered beam walking test)和粘附物去除實(shí)驗(yàn)(Adhesive removal test),檢測(cè)鼻腔(Intranasal administration)或皮下(Subcutaneous injection)給予TP對(duì)大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為的影響;通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)鼻腔或皮下給予TP對(duì)大鼠尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響;通過(guò)RT-PCR技術(shù),免疫印跡以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)鼻腔或皮下給予TP對(duì)大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能體系中VMAT2表達(dá)的影響;通過(guò)給予VMAT2阻斷劑利血平,探討TP對(duì)上述指標(biāo)的影響是否與VMAT2相關(guān);在細(xì)胞水平探討TP對(duì)多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制是否通過(guò)雄激素受體途徑實(shí)現(xiàn)的。第一部分丙酸睪酮改善老年大鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為目的:探討長(zhǎng)期鼻腔或皮下TP替代對(duì)大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為的影響。方法:通過(guò)網(wǎng)格棒下降、楔形板行走和粘附物去除實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠協(xié)同運(yùn)動(dòng)行為。結(jié)果:1通過(guò)網(wǎng)格棒下降實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),24Mon大鼠網(wǎng)格棒停留時(shí)間較6Mon大鼠短(P0.01);長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠停留時(shí)間較24Mon組延長(zhǎng)(鼻腔95.21%、皮下55.02%)(P0.01)差異顯著。2通過(guò)楔形板行走實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),24Mon大鼠雙后肢楔形板評(píng)分較6Mon大鼠高(P0.01);長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠雙后肢評(píng)分較24Mon組降低(左后肢,鼻腔22.56%、皮下11.24%;右后肢,鼻腔19.33%、皮下13.32%)(P0.01)。3通過(guò)粘附物去除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),24Mon組大鼠鼻左、右側(cè)粘附物去除時(shí)間較6Mon大鼠長(zhǎng)(P0.01);長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠鼻部雙側(cè)粘附物去除時(shí)間較24Mon組縮短(左側(cè):鼻腔39.29%、皮下38.29%;右側(cè):鼻腔50.11%、皮下40.64%)(P0.01)。24Mon組大鼠兩前肢粘附物去除時(shí)間較6Mon大鼠長(zhǎng)(P0.01);長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠兩前肢粘附物去除時(shí)間分別較24Mon組縮短(左側(cè):鼻腔48.31%、皮下57.63%;右側(cè):鼻腔49.81%、皮下61.34%)(P0.01)。結(jié)論:1老年大鼠表現(xiàn)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為缺陷。2老年大鼠長(zhǎng)期給予TP替代后,協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為缺陷改善。3老年大鼠鼻腔給予TP對(duì)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為缺陷的改善優(yōu)于皮下給藥。第二部分丙酸睪酮增強(qiáng)老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的功能活動(dòng)目的:探討長(zhǎng)期鼻腔或皮下TP替代對(duì)大鼠尾殼核DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響。方法:通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)大鼠尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物的含量。結(jié)果:24Mon組大鼠CPu處DA及其代謝產(chǎn)物水平均較6Mon組明顯改變,DA、DOPAC和HVA含量(P0.01)明顯降低;DOPAC+HVA/DA、DOPAC/DA和HVA/DA比值(P0.01)明顯升高;給予TP長(zhǎng)期處理后,老年大鼠DA及其代謝產(chǎn)物含量均較24Mon組明顯改變,其中DA(鼻腔131.46%、皮下53.87%)、DOPAC(鼻腔38.24%、皮下27.82%)和HVA(鼻腔33.25%、皮下15.79%)(P0.01)明顯升高;DOPAC+HVA/DA(鼻腔35.79%、皮下18.61%)、DOPAC/DA(鼻腔35.24%、皮下16.48%)和HVA/DA(鼻腔37.26%、皮下24.07%)(P0.01)明顯降低,鼻腔給藥組基本恢復(fù)到6Mon組水平(P0.05)。結(jié)論:1老年大鼠尾殼核內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量減少。2老年大鼠長(zhǎng)期TP替代后,尾殼核內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量增加,暗示黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的活性增強(qiáng)。3老年大鼠鼻腔給予TP對(duì)尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的改善優(yōu)于皮下給藥。第三部分丙酸睪酮增加老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2的目的:探討長(zhǎng)期鼻腔或皮下TP替代對(duì)老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2表達(dá)的影響。方法:通過(guò)RT-PCR檢測(cè)大鼠黑質(zhì)內(nèi)VMAT2 m RNA的RQ值,Western blot檢測(cè)大鼠黑質(zhì)和尾殼核內(nèi)VMAT2/GAPDH的比值,免疫組化法檢測(cè)老年大鼠黑質(zhì)和尾殼核內(nèi)VMAT2的平均光密度值和神經(jīng)元數(shù)目。結(jié)果:1利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)SN處VMAT2 m RNA的RQ值進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),24Mon組大鼠SN處VMAT2 m RNA的RQ值較6Mon組降低(P0.01);長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠SN處VMAT2 m RNA的RQ值較24Mon組增加(鼻腔77.14%、皮下35.69%)(P0.01),鼻腔給藥恢復(fù)到6Mon組水平(P0.05)。2利用Western blot法對(duì)SN處VMAT2蛋白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),24Mon大鼠SN處的Glyco-VMAT2、Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2的表達(dá)較6Mon組大鼠降低(P0.01)。長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠SN處的Glyco-VMAT2(鼻腔65.71%、皮下9.31%)、Partially glyco-VMAT2(鼻腔25.84%、皮下20.15%)和Native-VMAT2(鼻腔72.43%、皮下77.57%)的表達(dá)較24Mon組大鼠升高。鼻腔給藥組Partially glyco-VMAT2的表達(dá)恢復(fù)到6Mon組大鼠水平(P0.05)。3利用Western blot法對(duì)CPu處VMAT2蛋白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),24Mon大鼠CPu處的Glyco-VMAT2、Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2的表達(dá)較6Mon組大鼠降低(P0.01)。長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠CPu處的Glyco-VMAT2(鼻腔57.29%、皮下49.22%)、Partially glyco-VMAT2(鼻腔34.40%、皮下9.14%)和Native-VMAT2(鼻腔25.24%、皮下19.23%)的表達(dá)較24Mon組大鼠升高(P0.01)。鼻腔給藥組恢復(fù)到6Mon組大鼠水平(P0.05)。4利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)SN處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)發(fā)現(xiàn),24Mon組大鼠SN處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較6Mon組降低(P0.01);長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠SN處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較24Mon組增加(鼻腔27.97%、皮下22.88%)(P0.01)。5利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)SN處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性細(xì)胞AOD值檢測(cè)發(fā)現(xiàn),24Mon組大鼠SN處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性細(xì)胞AOD值較6Mon組降低(P0.01)。長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠SN處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性細(xì)胞AOD值較24Mon組增加(鼻腔6.90%、皮下8.75%)(P0.01)。6利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)CPu處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性神經(jīng)末梢AOD值檢測(cè)發(fā)現(xiàn),24Mon組大鼠CPu處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性神經(jīng)末梢AOD值較6Mon組降低(P0.01)。長(zhǎng)期TP處理后老年大鼠CPu處VMAT2-ir免疫陽(yáng)性神經(jīng)末梢AOD值較24Mon組增加(鼻腔20.18%、皮下6.95%)(P0.01),鼻腔給藥恢復(fù)到6Mon組水平(P0.05)。結(jié)論:1老年大鼠黑質(zhì)內(nèi)VMAT2-ir免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少,給予TP后增加。2老年大鼠黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2 m RNA和VMAT2蛋白表達(dá)減少。3老年大鼠長(zhǎng)期給予TP替代后,能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2表達(dá)。4老年大鼠鼻腔給予TP對(duì)黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元VMAT2的改善優(yōu)于皮下給藥。第四部分VMAT2參與丙酸睪酮對(duì)老年大鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為和黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元功能活動(dòng)的改善目的:探討老年大鼠TP長(zhǎng)期替代后協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為和黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的功能活動(dòng)明顯改善,是否與VMAT2表達(dá)增多相關(guān)。方法:應(yīng)用VMAT2長(zhǎng)效特異性抑制劑利血平預(yù)先處理老年大鼠,然后給予TP皮下替代治療。通過(guò)網(wǎng)格棒下降,楔形板行走和粘附物去除實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠協(xié)同運(yùn)動(dòng)行為,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)大鼠尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物的水平,RT-PCR檢測(cè)大鼠黑質(zhì)內(nèi)VMAT2 m RNA的RQ值,Western blot檢測(cè)大鼠黑質(zhì)和尾殼核內(nèi)VMAT2/GAPDH的比值。結(jié)果:1利血平處理(24Mon-R)組和利血平和TP處理(24Mon-R.TP)組大鼠網(wǎng)格棒下滑和楔形板行走無(wú)法進(jìn)行。2通過(guò)粘附物去除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),24Mon-R組大鼠鼻兩側(cè)和兩前肢粘附物去除時(shí)間分別較24Mon組大鼠長(zhǎng)(P0.01);24Mon-R.TP組大鼠鼻兩側(cè)和兩前肢粘附物去除時(shí)間均較24Mon-R組長(zhǎng)(P0.01)。3通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)老年大鼠尾殼核內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物的含量并計(jì)算其比率發(fā)現(xiàn),DA及其代謝產(chǎn)物(DOPAC和HVA)24Mon-R組明顯低于24Mon組(P0.01),DA代謝產(chǎn)物與DA的比值明顯升高(P0.01);24Mon-R.TP組尾殼核內(nèi)DA含量明顯低于24Mon-R組(P0.01),DA代謝產(chǎn)物(DOPAC和HVA)與24Mon-R組無(wú)明顯差異(P0.05),DA代謝產(chǎn)物與DA的比值明顯升高(P0.01)。4利用RT-PCR方法對(duì)SN核團(tuán)處VMAT2/GAPDH的RQ值進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),24Mon-R組與24Mon組無(wú)明顯變化(P0.05),24Mon-R.TP組明顯增加(P0.01)。5利用Western blot法對(duì)SN和CPu處VMAT2蛋白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Glyco-VMAT2、Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2與GAPDH免疫印跡條帶相對(duì)吸光度比值,24Mon-R組與24Mon組無(wú)明顯變化(P0.05),24Mon-R.TP組分別明顯增加(P0.05)。結(jié)論:1利血平抑制VMAT2的功能、減少DA及其代謝產(chǎn)物的含量、提高DA代謝產(chǎn)物與DA的比值和損傷協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為。2 TP對(duì)老年大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)行為和黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元功能的影響可能部分通過(guò)VMAT2實(shí)現(xiàn)的。第五部分睪酮提高SH-SY5Y細(xì)胞VMAT2表達(dá)與雄激素受體相關(guān)目的:在細(xì)胞水平探討睪酮(Testosterone,T)提高VMAT2表達(dá)和神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)雄激素受體(Androgen receptor,AR)實(shí)現(xiàn)的方法:RA/TPA分化的SH-SY5Y細(xì)胞作為DA神經(jīng)元體外研究模型;利用H2O2作為ROS激發(fā)劑;預(yù)先給予T和AR阻斷劑氟他胺(Flutamide,Flu)處理,通過(guò)MTT和LDH檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞損傷程度,通過(guò)免疫熒光和免疫印記檢測(cè)VMAT2表達(dá)的變化。結(jié)果:1 RA/TPA分化SH-SY5Y細(xì)胞后,出現(xiàn)胞體變圓變小,突起增長(zhǎng)等形態(tài)學(xué)變化。Neu N檢測(cè)結(jié)果顯示RA/TPA分化細(xì)胞Neu N的表達(dá)明顯(P0.01)高于未分化細(xì)胞。2 MTT和LDH檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照(Con)組、睪酮處理(T)組和睪酮和氟他胺處理(T+F)組三組間細(xì)胞活性沒(méi)有明顯變化(P0.05),過(guò)氧化氫處理(H)組、睪酮和過(guò)氧化氫處理(T+H)組和睪酮、氟他胺和過(guò)氧化氫處理(T+F+H)組三組細(xì)胞活性均較Con、T和T+F三組降低(P0.01),H和T+F+H組細(xì)胞活性低于T+H組(P0.01)。3免疫熒光結(jié)果顯示:Con和T+F組間AOD值沒(méi)有明顯差異(P0.05),H、T和T+F+H三組間AOD值沒(méi)有明顯差異(P0.05),H、T和T+F+H三組的AOD值明顯高于Con和T+F組(P0.01),T+H組明顯高于其余5組(P0.01)。4免疫印記結(jié)果顯示:Glyco-VMAT2與GAPDH免疫印跡條帶相對(duì)吸光度比值,H、T和T+F+H三組間沒(méi)有明顯差異(P0.05),H、T和T+F+H三組間明顯高于Con和T+F組(P0.01),T+H組明顯高于其余5組(P0.01)。Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2與GAPDH免疫印跡條帶相對(duì)吸光度比值,Con、H、T、T+F+H和T+F五組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),T+H組明顯高于其余5組(P0.01)。結(jié)論:1睪酮對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用部分通過(guò)AR實(shí)現(xiàn)的。2睪酮使SH-SY5Y細(xì)胞VMAT2表達(dá)提高部分通過(guò)AR實(shí)現(xiàn)的。3氧化應(yīng)激能夠通過(guò)非AR途徑提高VMAT2表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R965

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5 張，

本文編號(hào)：1462989