本文關鍵詞： 大型中性氨基酸轉運體1 主動靶向 谷氨酸 PLGA納米粒 活性調控　出處：《沈陽藥科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目前可供腫瘤主動靶向納米制劑選擇的受體種類較少,且其配體具有分子量大和體內穩(wěn)定性差等問題,尋找新的有效靶點是腫瘤主動靶向納米制劑設計中亟待解決的難點。對于腫瘤細胞表面特異性高表達的氨基酸轉運體,簡單的氨基酸修飾即可達到靶向目的,且氨基酸具有空間位阻小,體內穩(wěn)定性好等優(yōu)點。因此,本課題以腫瘤細胞高表達的大中性氨基酸轉運體1(LAT1)為靶點,谷氨酸為靶頭,制備具有LAT1靶向性的PLGA納米粒,考察靶向納米粒在腫瘤細胞中的攝取能力和腫瘤組織中的滯留性,探索LAT1成為新型腫瘤靶向策略的可行性。首先,利用聚乙二醇單硬脂酸酯的羥基與N-芐氧羰基-L-谷氨酸-1-芐酯的羧基之間的酯化反應,成功制備了具有不同PEG鏈長的谷氨酸-聚乙二醇單硬脂酸酯靶向材料。采用'H-NMR對靶向材料的結構進行鑒定,GPC對靶向材料的分子量及其分子量分布進行考察。結果表明,氨基酸成功地修飾于聚乙二醇單硬脂酸酯的PEG鏈末端,并且該合成過程簡便易行,重復性高；GPC結果證明該靶向材料具有較好的純度。以紫杉醇(PTX)為模型藥物,谷氨酸-聚乙二醇單硬脂酸酯為修飾材料,PLGA為藥物儲庫,采用乳化溶劑揮發(fā)法制備不同PEG鏈長、不同配體修飾度的載藥納米粒(5% SPGn PTXNPs和10% SPGn PTX NPs)。所制備的載藥納米粒的包封率在70～95%,載藥量在4%左右。納米粒的粒徑在152 nm～181 nm,TEM電鏡結果顯示納米粒呈球形,粒徑均勻。利用透析法考察了載藥納米粒的體外釋放行為,結果表明延長PEG鏈或增加修飾材料的密度均能降低PTX的體外釋放速度。以粒徑為指標,考察了不同靶向納米粒在10% FBS中的穩(wěn)定性,結果顯示,靶向納米粒具有較好的穩(wěn)定性。以MCF-7、HeLa腫瘤細胞和NIH 3T3成纖維細胞為研究對象,利用免疫熒光法定性觀察LAT1在所選擇細胞中的表達情況,結果顯示,MCF-7和HeLa細胞高表達LAT1、NIH 3T3細胞低表達LAT1。以非靶向納米粒為對照,考察不同配體修飾度和不同PEG鏈長的靶向納米粒的在MCF-7、HeLa腫瘤細胞和NIH3T3細胞中的LAT1靶向效果、細胞毒性、內涵體／溶酶體逃逸及細胞結合、攝取機制。細胞毒性試驗結果表明,靶向納米粒表面配體修飾度的增加有利于增強納米粒對細胞的抑制能力。細胞攝取結果表明,靶向納米粒能提高未修飾納米粒在LAT1高表達細胞中的攝取,而在LAT1低表達細胞中靶向納米粒沒有表現(xiàn)明顯的攝取優(yōu)勢。當靶向修飾度為10%,PEG分子量為1000時,細胞攝取提高更為明顯,結合納米粒的體外研究,確定10% SPG25 NPs為最佳LAT1靶向納米粒。采用激光共聚焦定性觀察靶向納米粒的亞細胞器分布情況,發(fā)現(xiàn)靶向納米粒具有一定的內涵體/溶酶體逃逸能力。細胞內吞抑制實驗表明靶向納米粒主要以網(wǎng)格蛋白介導的內吞進入細胞。在低溫條件下,考察了LAT1的轉運能力,結果表明靶向納米粒能與LAT1發(fā)生結合,且對于LAT1介導的內吞,結合是細胞內吞的限速步驟。在37-C孵化條件下,通過競爭性抑制實驗證明靶向納米粒是通過LAT1介導的內吞進入細胞。采用免疫熒光法和Western blot初步考察在靶向納米粒的細胞內吞過程中對LAT1的影響,結果表明,靶向納米粒結合細胞膜上的LAT1后,經(jīng)內吞進入細胞,隨著內涵體酸化或離子強度的變化,LAT1和靶向納米粒表面的谷氨酸結合力減弱并分離,靶向納米粒進入溶酶體,LAT1返回至細胞膜上,從而保證了細胞膜上有足夠的LAT1與細胞外的靶向納米粒結合、內吞。以4T1荷瘤小鼠為模型,利用活體成像儀考察靶向和非靶向納米粒在荷瘤小鼠中的組織分布。實驗結果表明,PEG化修飾能顯著降低納米粒的肝脾吞噬,谷氨酸修飾提高了靶向納米粒在腫瘤部位的蓄積。以4T1荷瘤小鼠為模型,評價Taxol溶液劑、10% SP25 PTX NPs和10% SPG25 PTX NPs的抑瘤效果。與生理鹽水組相比,給藥組明顯抑制腫瘤的生長,且10% SPG25 PTX NPs靶向納米粒具有更好的腫瘤抑制效果。同時,與Taxol相比,10% SPG25 PTX NPs具有更好的安全性。此外,研究表明LAT1在血腦屏障和腦膠質瘤細胞上均高表達,并且LAT1在血腦屏障上對底物的親和性遠高于在其他組織中的LAT1。在前期研究基礎上,合成了谷氨酸-TPGS修飾材料,制備谷氨酸修飾的脂質體,對該脂質體進行了體外制劑學評價,大鼠腦膠質瘤細胞的毒性試驗和攝取試驗,以及小鼠體內跨血腦屏障的初步研究。結果表明,與未修飾的脂質體相比,谷氨酸修飾促進了非靶向脂質體的細胞抑制能力,細胞攝取和跨血腦屏障能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：沈陽藥科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943

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