本文關鍵詞：多肽修飾的脂質體靶向腫瘤輸送過程的研究　出處：《上海交通大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：腫瘤是由于遺傳突變和外界環(huán)境等多種因素的刺激,誘發(fā)人體自身細胞不能進行正常的生長調控,導致細胞增殖失控的疾病,是目前嚴重威脅人類生命的惡性疾病�；瘜W治療是臨床上常規(guī)的治療手段。但是普通化療由于缺乏特異性,在殺傷腫瘤細胞的同時,也同樣作用于正常組織,造成極大的毒副作用。因此如何實現(xiàn)體內特異性靶向腫瘤細胞的藥物輸送,避免對正常組織細胞功能的損害顯得尤為重要。目前已上市的具有腫瘤靶向性藥物輸送系統(tǒng)中,有單克隆抗體、聚合物、膠束、納米粒和脂質體。其中脂質體藥物輸送系統(tǒng)因載體材料的安全性和生物相容性高等優(yōu)勢一直是研究的熱點,這些不同類型脂質體包括通過EPR效應被動靶向腫瘤組織的長循環(huán)脂質體,配體修飾的主動靶向腫瘤細胞的免疫脂質體,對外界因素如光、熱、磁、PH敏感的物理/化學靶向脂質體,以及具有多功能的智能(smart)脂質體等,都能有效的實現(xiàn)脂質體藥物在腫瘤部位的聚集和釋放,降低毒副作用,保護藥物在體內循環(huán)系統(tǒng)中不被降解,延長循環(huán)時間。然而臨床統(tǒng)計數據顯示,通過系統(tǒng)給藥后的靶向脂質體雖然能在腫瘤部位有效的聚集,但并不一能顯著的全面提高患者總的生存期。因此,對于影響靶向脂質體藥物在腫瘤部位的分布及其殺傷效應的生理屏障因素,需要進行系統(tǒng)和深入的研究。在研究中,我們以EGFR為靶點,設計了配體修飾的腫瘤靶向的脂質體藥物輸送系統(tǒng)。研究表明EGFR在許多實體腫瘤中存在高表達或異常表達,與腫瘤細胞的增殖、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和轉移以及腫瘤細胞凋亡相關。在本實驗中,我們選用了通過噬菌體展示肽庫篩選的靶向egfr的十二肽ge11(yhwygytpqnvi)作為配體,制備了ge11修飾的主動靶向egfr的脂質體輸送系統(tǒng),并對影響其體內外的腫瘤靶向性,抗腫瘤效果的處方因素,以及經靜脈給藥后,到達腫瘤細胞過程中存在的瘤內生理屏障進行了深入的研究。首先,我們通過一步合成法得到高純度的ge11修飾的脂質材料dspe-peg2000-mal-ge11,對構成脂質體的各脂質成分建立了hplc-elsd定量方法,考察脂質體中各脂質處方比對ge11修飾的主動靶向脂質體穩(wěn)定性,粒徑變化,聚集狀態(tài),包封率的影響,得到制備穩(wěn)定的ge11修飾的主動靶向脂質體的各脂質處方比例范圍。為了考察不同表面密度多肽ge11和peg2000修飾的脂質體對egfr的靶向性能,我們選擇了三種表達egfr的不同細胞株h1299、4t1、smmc7721,通過流式細胞儀和共聚焦熒光顯微鏡觀察不同表面密度ge11和peg2000修飾的脂質體在不同細胞株中吸附和攝取的行為。我們觀察到與直接作用于細胞受體的靶向配體(單克隆抗體、多肽)不同,經配體修飾的脂質體與膜表面受體結合攝取,會受到處方,細胞類型、配體在載體表面的密度等多方面因素的影響。通過體外細胞實驗,篩選出了與體外egfr高表達腫瘤細胞特異性結合最優(yōu)的三個處方,其peg與ge11的百分摩爾比分別為(3.5:0.5),(4:2),和(6:2)。為了考察這三個優(yōu)化處方經系統(tǒng)給藥后在體內的分布和腫瘤靶向行為的特點。我們通過主動載藥的方法制備了這三個不同處方的阿霉素脂質體。經尾靜脈給藥后,通過對血液和各組織中不同時間點阿霉素的含量測定,研究修飾了不同表面密度靶向配體ge11的阿霉素脂質體在荷smmc7721皮下移植瘤的動物模型中體內半衰期、組織分布以及由此引起的不同的腫瘤抑制效果。腫瘤體積生長抑制率和生存率結果顯示,雖然經ge11修飾的主動靶向阿霉素脂質體體內半衰期有所下降,但與只含peg的被動靶向長循環(huán)阿霉素脂質體比,仍具有明顯的抑瘤效果。為了更好地觀察ge11修飾的基于主動靶向機理的脂質體輸送系統(tǒng)抗腫瘤的機理,和其向腫瘤組織內部擴散存在的生理屏障,我們對實驗中抑瘤效果存在顯著性差異的兩個處方,在smmc7721皮下移植瘤的分布進行了細節(jié)的研究。兩個處方,一個只含4%peg的脂質體處方,一個是含4%peg和2%ge11脂質體處方。前者主要通過epr效應實現(xiàn)在腫瘤部位的聚集,后者可以通過ge11結合腫瘤細胞的高表達的egfr,主動靶向到腫瘤組織。我們選用組織切片技術和免疫組化的方法,觀察腫瘤組織的結構形態(tài)及某些特定瘤內成分對脂質體到達腫瘤組織的影響。從最終得到的clsm圖片中,我們觀察到靶向egfr的含4%peg和2%ge11的脂質體,相比較只基于epr效應實現(xiàn)腫瘤靶向的只含4%peg的脂質體,能夠更有效的在短時間內(1h)實現(xiàn)脂質體在smmc7721瘤組織新生血管區(qū)的聚集。我們還對smmc7721腫瘤組織的i型膠原纖維、iv型膠原纖維、瘤內表達的egfr進行ihc染色標記,觀察到與正常的肝組織不同,i型膠原纖維在smmc7721肝癌組織中的表達明顯增加,分布在smmc7721腫瘤細胞球周圍。這些瘤內膠原纖維的存在,使得只含4%peg的脂質體和含4%peg和2%ge11的脂質體都不能有效的到達腫瘤細胞。為了使脂質體更均勻有效的分布在smmc7721皮下移植瘤中,我們根據smmc7721腫瘤的特點,選擇了兩種方法來觀察其是否能幫助這兩種脂質體向瘤間質擴散到達腫瘤細胞。一是選擇尾靜脈注射i型膠原酶1h后,再給予羅丹明標記的脂質體;二是選了一種證實可以促進細胞內吞的環(huán)形肽irgd,與羅丹明脂質體同時尾靜脈注射。羅丹明脂質體注射1h后的切片圖譜顯示,無論是i型膠原酶還是irgd,對含4%peg和2%ge11的脂質體在瘤內分布的影響并無影響;對只含4%PEG的脂質體脂質體,I型膠原酶對其卻有著明顯的影響,能促進其在血管邊緣區(qū)的聚集。但是都不能有效的幫助脂質體跨過間質屏障到達腫瘤細胞。從CLSM圖中,我們也觀察到EGFR除了在SMMC7721細胞表達外,也在瘤間質細胞過高表達。我們認為影響GE11修飾的主動靶向脂質體向瘤間質進一步擴散的主要原因是廣泛表達的EGFR間質細胞形成的“受體結合的屏障”,即新生血管區(qū)高表達EGFR的基質細胞形成的一種屏障,經GE11修飾的脂質體首先會在新生血管區(qū)與其結合后,就很難進一步向瘤間質深處擴散。經GE11修飾的主動靶向EGFR阿霉素脂質體主要是通過作用于高表達EGFR的間質細胞,更有效的殺傷間質細胞,破壞腫瘤細胞賴以生存的微環(huán)境,來達到比PEG脂質體更好的抑瘤效果。綜上,本論文的研究主要內容:通過一步合成法得到高純度的GE11修飾的脂質材料DSPE-PEG2000-Mal-GE11,考察了不同表面密度多肽GE11和PEG2000修飾的脂質體對EGFR的靶向性能的影響,并對GE11修飾的主動靶向阿霉素脂質體體內的藥動、藥效、組織分布、抗腫瘤的機理以及輸送屏障進行了研究。通過對靶向脂質體在體內輸送的關鍵環(huán)節(jié)及其影響因素進行深入研究,明確影響靶向脂質體體內輸送效率的機理,可以為設計和構建優(yōu)化的靶向脂質體藥物載體系統(tǒng)奠定基礎。同時也可以為其它類型的靶向制劑的設計和構建提供參考,突破腫瘤靶向制劑的瓶頸問題。
[Abstract]:A liposome drug delivery system targeting egfr , which has been successfully used in tumor cells , has been studied in this experiment . In order to investigate the effects of different surface density polypeptide ge11 and liposome 2000 modified liposomes on tumor targeting behavior , three different formulations of adriamycin liposomes with different surface density targeting ligand ge11 were studied .

【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R943
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本文編號：1429652