本文關(guān)鍵詞：多肽修飾的脂質(zhì)體靶向腫瘤輸送過程的研究　出處：《上海交通大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：腫瘤是由于遺傳突變和外界環(huán)境等多種因素的刺激,誘發(fā)人體自身細(xì)胞不能進(jìn)行正常的生長調(diào)控,導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控的疾病,是目前嚴(yán)重威脅人類生命的惡性疾病。化學(xué)治療是臨床上常規(guī)的治療手段。但是普通化療由于缺乏特異性,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時,也同樣作用于正常組織,造成極大的毒副作用。因此如何實現(xiàn)體內(nèi)特異性靶向腫瘤細(xì)胞的藥物輸送,避免對正常組織細(xì)胞功能的損害顯得尤為重要。目前已上市的具有腫瘤靶向性藥物輸送系統(tǒng)中,有單克隆抗體、聚合物、膠束、納米粒和脂質(zhì)體。其中脂質(zhì)體藥物輸送系統(tǒng)因載體材料的安全性和生物相容性高等優(yōu)勢一直是研究的熱點,這些不同類型脂質(zhì)體包括通過EPR效應(yīng)被動靶向腫瘤組織的長循環(huán)脂質(zhì)體,配體修飾的主動靶向腫瘤細(xì)胞的免疫脂質(zhì)體,對外界因素如光、熱、磁、PH敏感的物理/化學(xué)靶向脂質(zhì)體,以及具有多功能的智能(smart)脂質(zhì)體等,都能有效的實現(xiàn)脂質(zhì)體藥物在腫瘤部位的聚集和釋放,降低毒副作用,保護(hù)藥物在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中不被降解,延長循環(huán)時間。然而臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,通過系統(tǒng)給藥后的靶向脂質(zhì)體雖然能在腫瘤部位有效的聚集,但并不一能顯著的全面提高患者總的生存期。因此,對于影響靶向脂質(zhì)體藥物在腫瘤部位的分布及其殺傷效應(yīng)的生理屏障因素,需要進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究。在研究中,我們以EGFR為靶點,設(shè)計了配體修飾的腫瘤靶向的脂質(zhì)體藥物輸送系統(tǒng)。研究表明EGFR在許多實體腫瘤中存在高表達(dá)或異常表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。在本實驗中,我們選用了通過噬菌體展示肽庫篩選的靶向egfr的十二肽ge11(yhwygytpqnvi)作為配體,制備了ge11修飾的主動靶向egfr的脂質(zhì)體輸送系統(tǒng),并對影響其體內(nèi)外的腫瘤靶向性,抗腫瘤效果的處方因素,以及經(jīng)靜脈給藥后,到達(dá)腫瘤細(xì)胞過程中存在的瘤內(nèi)生理屏障進(jìn)行了深入的研究。首先,我們通過一步合成法得到高純度的ge11修飾的脂質(zhì)材料dspe-peg2000-mal-ge11,對構(gòu)成脂質(zhì)體的各脂質(zhì)成分建立了hplc-elsd定量方法,考察脂質(zhì)體中各脂質(zhì)處方比對ge11修飾的主動靶向脂質(zhì)體穩(wěn)定性,粒徑變化,聚集狀態(tài),包封率的影響,得到制備穩(wěn)定的ge11修飾的主動靶向脂質(zhì)體的各脂質(zhì)處方比例范圍。為了考察不同表面密度多肽ge11和peg2000修飾的脂質(zhì)體對egfr的靶向性能,我們選擇了三種表達(dá)egfr的不同細(xì)胞株h1299、4t1、smmc7721,通過流式細(xì)胞儀和共聚焦熒光顯微鏡觀察不同表面密度ge11和peg2000修飾的脂質(zhì)體在不同細(xì)胞株中吸附和攝取的行為。我們觀察到與直接作用于細(xì)胞受體的靶向配體(單克隆抗體、多肽)不同,經(jīng)配體修飾的脂質(zhì)體與膜表面受體結(jié)合攝取,會受到處方,細(xì)胞類型、配體在載體表面的密度等多方面因素的影響。通過體外細(xì)胞實驗,篩選出了與體外egfr高表達(dá)腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合最優(yōu)的三個處方,其peg與ge11的百分摩爾比分別為(3.5:0.5),(4:2),和(6:2)。為了考察這三個優(yōu)化處方經(jīng)系統(tǒng)給藥后在體內(nèi)的分布和腫瘤靶向行為的特點。我們通過主動載藥的方法制備了這三個不同處方的阿霉素脂質(zhì)體。經(jīng)尾靜脈給藥后,通過對血液和各組織中不同時間點阿霉素的含量測定,研究修飾了不同表面密度靶向配體ge11的阿霉素脂質(zhì)體在荷smmc7721皮下移植瘤的動物模型中體內(nèi)半衰期、組織分布以及由此引起的不同的腫瘤抑制效果。腫瘤體積生長抑制率和生存率結(jié)果顯示,雖然經(jīng)ge11修飾的主動靶向阿霉素脂質(zhì)體體內(nèi)半衰期有所下降,但與只含peg的被動靶向長循環(huán)阿霉素脂質(zhì)體比,仍具有明顯的抑瘤效果。為了更好地觀察ge11修飾的基于主動靶向機理的脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)抗腫瘤的機理,和其向腫瘤組織內(nèi)部擴散存在的生理屏障,我們對實驗中抑瘤效果存在顯著性差異的兩個處方,在smmc7721皮下移植瘤的分布進(jìn)行了細(xì)節(jié)的研究。兩個處方,一個只含4%peg的脂質(zhì)體處方,一個是含4%peg和2%ge11脂質(zhì)體處方。前者主要通過epr效應(yīng)實現(xiàn)在腫瘤部位的聚集,后者可以通過ge11結(jié)合腫瘤細(xì)胞的高表達(dá)的egfr,主動靶向到腫瘤組織。我們選用組織切片技術(shù)和免疫組化的方法,觀察腫瘤組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)及某些特定瘤內(nèi)成分對脂質(zhì)體到達(dá)腫瘤組織的影響。從最終得到的clsm圖片中,我們觀察到靶向egfr的含4%peg和2%ge11的脂質(zhì)體,相比較只基于epr效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤靶向的只含4%peg的脂質(zhì)體,能夠更有效的在短時間內(nèi)(1h)實現(xiàn)脂質(zhì)體在smmc7721瘤組織新生血管區(qū)的聚集。我們還對smmc7721腫瘤組織的i型膠原纖維、iv型膠原纖維、瘤內(nèi)表達(dá)的egfr進(jìn)行ihc染色標(biāo)記,觀察到與正常的肝組織不同,i型膠原纖維在smmc7721肝癌組織中的表達(dá)明顯增加,分布在smmc7721腫瘤細(xì)胞球周圍。這些瘤內(nèi)膠原纖維的存在,使得只含4%peg的脂質(zhì)體和含4%peg和2%ge11的脂質(zhì)體都不能有效的到達(dá)腫瘤細(xì)胞。為了使脂質(zhì)體更均勻有效的分布在smmc7721皮下移植瘤中,我們根據(jù)smmc7721腫瘤的特點,選擇了兩種方法來觀察其是否能幫助這兩種脂質(zhì)體向瘤間質(zhì)擴散到達(dá)腫瘤細(xì)胞。一是選擇尾靜脈注射i型膠原酶1h后,再給予羅丹明標(biāo)記的脂質(zhì)體;二是選了一種證實可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞的環(huán)形肽irgd,與羅丹明脂質(zhì)體同時尾靜脈注射。羅丹明脂質(zhì)體注射1h后的切片圖譜顯示,無論是i型膠原酶還是irgd,對含4%peg和2%ge11的脂質(zhì)體在瘤內(nèi)分布的影響并無影響;對只含4%PEG的脂質(zhì)體脂質(zhì)體,I型膠原酶對其卻有著明顯的影響,能促進(jìn)其在血管邊緣區(qū)的聚集。但是都不能有效的幫助脂質(zhì)體跨過間質(zhì)屏障到達(dá)腫瘤細(xì)胞。從CLSM圖中,我們也觀察到EGFR除了在SMMC7721細(xì)胞表達(dá)外,也在瘤間質(zhì)細(xì)胞過高表達(dá)。我們認(rèn)為影響GE11修飾的主動靶向脂質(zhì)體向瘤間質(zhì)進(jìn)一步擴散的主要原因是廣泛表達(dá)的EGFR間質(zhì)細(xì)胞形成的“受體結(jié)合的屏障”,即新生血管區(qū)高表達(dá)EGFR的基質(zhì)細(xì)胞形成的一種屏障,經(jīng)GE11修飾的脂質(zhì)體首先會在新生血管區(qū)與其結(jié)合后,就很難進(jìn)一步向瘤間質(zhì)深處擴散。經(jīng)GE11修飾的主動靶向EGFR阿霉素脂質(zhì)體主要是通過作用于高表達(dá)EGFR的間質(zhì)細(xì)胞,更有效的殺傷間質(zhì)細(xì)胞,破壞腫瘤細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境,來達(dá)到比PEG脂質(zhì)體更好的抑瘤效果。綜上,本論文的研究主要內(nèi)容:通過一步合成法得到高純度的GE11修飾的脂質(zhì)材料DSPE-PEG2000-Mal-GE11,考察了不同表面密度多肽GE11和PEG2000修飾的脂質(zhì)體對EGFR的靶向性能的影響,并對GE11修飾的主動靶向阿霉素脂質(zhì)體體內(nèi)的藥動、藥效、組織分布、抗腫瘤的機理以及輸送屏障進(jìn)行了研究。通過對靶向脂質(zhì)體在體內(nèi)輸送的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及其影響因素進(jìn)行深入研究,明確影響靶向脂質(zhì)體體內(nèi)輸送效率的機理,可以為設(shè)計和構(gòu)建優(yōu)化的靶向脂質(zhì)體藥物載體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。同時也可以為其它類型的靶向制劑的設(shè)計和構(gòu)建提供參考,突破腫瘤靶向制劑的瓶頸問題。
[Abstract]:A liposome drug delivery system targeting egfr , which has been successfully used in tumor cells , has been studied in this experiment . In order to investigate the effects of different surface density polypeptide ge11 and liposome 2000 modified liposomes on tumor targeting behavior , three different formulations of adriamycin liposomes with different surface density targeting ligand ge11 were studied .

【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R943
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本文編號：1429652