本文關(guān)鍵詞：靶向PRMT5和BRD4蛋白的藥物發(fā)現(xiàn)及機(jī)制研究　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：表觀遺傳學(xué)指的是基因表達(dá)發(fā)生可遺傳變化,但是在染色體不改變DNA序列的前提下。即由環(huán)境因素引起遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的,可逆的,可遺傳的變化。DNA甲基化,組蛋白修飾,染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控,這四種方式是表觀遺傳在基因表達(dá)調(diào)節(jié)過程中作用的主要方式。過去幾十年里,大量研究報道證實,表觀遺傳發(fā)生在多種生物反應(yīng)過程中,參與調(diào)控腫瘤、糖尿病、免疫和代謝性疾病等人類疾病的發(fā)生和病理進(jìn)程。闡明表觀遺傳與疾病的相關(guān)機(jī)制,有助于為研制藥物和治療疾病方案設(shè)計提供依據(jù)和方向。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶是催化組蛋白或非組蛋白甲基化修飾的一種酶,并且其甲基化修飾是真核細(xì)胞常見的轉(zhuǎn)錄后修飾。已證實,在幾種人類惡性腫瘤中,蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào),可見其在腫瘤形成發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。此外,PRMT5已經(jīng)被確證為套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)的治療靶標(biāo)。在本研究中,我們基于計算輔助藥物設(shè)計虛擬篩選的手段,以靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)、藥效團(tuán)和分子對接等信息為基礎(chǔ)對化合物庫進(jìn)行高通量虛擬篩選,結(jié)合藥物化學(xué)合成修飾的方法,發(fā)現(xiàn)了有效地且有選擇性地PRMT5小分子抑制劑。通過討論結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR),確證了其骨架的有效性,為合成優(yōu)化先導(dǎo)化合物并增強(qiáng)其選擇性提供線索和依據(jù)。最終篩選出具有0.33 μM的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)和廣泛選擇性的苗頭化合物17。在細(xì)胞水平實驗中,化合物17表現(xiàn)出對白血病和淋巴瘤細(xì)胞增殖抑制的效果,同時,選擇性的表現(xiàn)出最有效抑制人白血病MV4-11細(xì)胞的增殖作用。此外,化合物17通過以一定時間和濃度依賴性抑制PRMT5底物SmD3對稱二甲基化修飾的表達(dá)水平。表明化合物17的生物抗增殖作用是抑制PRMT5底物SmD3表達(dá)的直接結(jié)果。這些靶標(biāo)實驗證實化合物17的確為靶向PRMT5蛋白的新型小分子探針。Bromodomain是能夠特異識別乙酰化組蛋白的結(jié)構(gòu)域。BRD4作為BET蛋白家族的一部分,是識別組蛋白乙酰化的識別因子。BRD4在維持體內(nèi)組蛋白乙酰化水平上發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,也可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控CDK6,BCL2,C-MYC等下游靶基因,最終起到穩(wěn)定的抗癌作用。已經(jīng)確證BRD4作為治療多種血液病及實體瘤的一種靶點,包括AML,ALL,MLL,MM以及肺癌和中線癌等。JQ1,IBET151以及IBET762等陽性化合物的發(fā)現(xiàn),推動了靶向BET家族小分子抑制劑的研究發(fā)展。在本研究中,將對體外篩選出的苗頭化合物進(jìn)行細(xì)胞表征研究。在細(xì)胞增殖實驗中,化合物DCBD008對THP-1細(xì)胞增殖表現(xiàn)出明顯的抑制活性,IC50=8.098 μM,結(jié)果與陽性化合物JQ1,IBET表征結(jié)果一致。并且證實DCBD008通過誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)入正常分裂期。并通過調(diào)控C-MYC等重要基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞周期以及凋亡發(fā)揮抗癌作用。結(jié)果顯示,給藥后,THP-1細(xì)胞中CDK6,BCL2和C-MYC基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出濃度依賴性的下降,表明化合物DCBD008在THP-1細(xì)胞內(nèi)是通過靶向抑制BRD4來發(fā)揮抗癌作用的。該課題為靶向BRD4蛋白的藥物發(fā)現(xiàn)及機(jī)制研究提供了新的小分子骨架。
[Abstract]:Epigenetics refers to heritable changes in gene expression, but in the premise of chromosomes do not alter the sequence of DNA. From the environmental factors caused by genetic material stable, reversible, but genetic changes in.DNA methylation, histone modification, chromatin remodeling and non encoding RNA control, the four way is to watch the concept of expression mainly in the regulation process of the role of genetic gene. In the past few decades, a large number of studies confirmed that epigenetic inheritance occurs in a variety of biological processes, involved in the regulation of tumor, diabetes, occurrence and pathological process of immune and metabolic diseases such as human disease. Clarify the mechanism of epigenetic form and illness. Helps to provide basis and direction for the development of drug design and treatment of the disease. The protein arginine methyltransferase is an enzyme that catalyzes histone and non histone methylation, and its methylation modification Is the common transcription of eukaryotic cells. After modification has been confirmed in several human malignancies, protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) expression were up-regulated in tumor formation, which play an important role in the process of development. In addition, PRMT5 has been confirmed as a cell lymphoma (MCL). Treatment targets. In this study, we design computer aided drug virtual screening method based on the three-dimensional structure, target, pharmacophore model and molecular docking information for high-throughput virtual screening of compound libraries, combined with the method of chemical synthesis drug modified, found effective and selective small molecule inhibitor of PRMT5. Through the discussion of structure-activity relationship (SAR), confirmed the effectiveness of the framework, for the synthesis optimization of lead compounds and enhance the selectivity to provide clues and basis. Finally screened with 0.33 M half inhibitory concentration (IC5Q) and wide selection of signs of compound 17. at the cellular level in the experiment, 17 compounds showed inhibition of leukemia and lymphoma cell proliferation effect, at the same time, exhibit selective proliferation of the most effective inhibition of human leukemia MV4-11 cells. In addition, 17 compounds by inhibiting expression levels of PRMT5 substrate SmD3 methylation in symmetric two a certain period of time and concentration dependent. Show that the anti proliferative effect of biological compound 17 is a direct result of the inhibition of PRMT5 SmD3 expression. These target substrate experiments confirmed that compound 17 is indeed targeting new type PRMT5 protein small molecule probe.Bromodomain is able to identify specific histone acetylation domains of.BRD4 as part of the BET protein family that is to play a key role recognition factor.BRD4 recognition of histone acetylation in vivo to maintain the level of histone acetylation and transcriptional regulation can also be BCL2, control CDK6, C-MYC downstream target genes and eventually play anticancer effect and stability. Have identified BRD4 as a target for the treatment of a variety of hematologic and solid tumors including AML, ALL, MLL, MM and lung cancer and cancer line.JQ1, IBET151 and IBET762 positive compounds is promoted study on the targeted development of small molecule inhibitors of the BET family. In this study, the signs of compounds were screened in vitro cell characterization. In cell proliferation experiment, compound DCBD008 on the proliferation of THP-1 cells showed obvious inhibitory activity of IC50=8.098, M, and the positive compounds JQ1, IBET and characterization results. DCBD008 confirmed by inducing THP-1 cell cycle arrest in G0/G1 phase, leading to cell division can not enter the normal period. And the expression of key genes regulating transcription through C-MYC, thereby affecting the cell cycle and apoptosis play a role in cancer . the results showed that after administration of CDK6, THP-1 cells, expression of BCL2 and C-MYC genes showed a concentration dependent decrease, showed that the compound DCBD008 is through targeted inhibition of BRD4 play a role in cancer in THP-1 cells. The research target provides a new research framework of small molecule drugs to BRD4 protein the discovery and mechanism.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R91

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本文編號：1429232