本文關(guān)鍵詞：頂頭孢霉中噻唑合成酶的鑒定及硫胺素對CPC產(chǎn)量的影響　出處：《上海醫(yī)藥工業(yè)研究院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢菌素C的主要工業(yè)生產(chǎn)菌是絲狀真菌頂頭孢霉。近年來,頭孢菌素C的發(fā)酵產(chǎn)量雖已得到大幅提升,但工業(yè)生產(chǎn)菌株和野生菌株中存在的代謝差異方面的分子機理仍然不是很清楚。本實驗室建立了頂頭孢霉高低產(chǎn)菌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)平臺,并從中發(fā)現(xiàn)了具有顯著差異表達的蛋白ActhiS。對頂頭孢霉的總RNA序列進行Illumina sequence分析得到了總的cDNA序列,從中找到了ActhiS蛋白的編碼基因Acthi。經(jīng)過初步的序列比對,發(fā)現(xiàn)ActhiS很可能是負(fù)責(zé)硫胺素合成過程中的噻唑合成酶。通過構(gòu)建沉默突變株和過表達突變株,證明了Acthi基因參與硫胺素的合成,并影響頭孢菌素C的合成。本文針對ActhiS蛋白,采用體外生物化學(xué)方法對其功能進行進一步的研究,包括以下兩方面的內(nèi)容:一、體外表達重組菌,純化ActhiS蛋白,進行體外酶催化,核磁鑒定終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),最終確定ActhiS的功能;二、研究頂頭孢霉培養(yǎng)基中添加硫胺素對CPC合成的影響。主要結(jié)果如下:在進行ActhiS蛋白的活性鑒定時,發(fā)現(xiàn)了在LB培養(yǎng)基中表達純化的ActhiS蛋白經(jīng)熱變性后其可以釋放小分子化合物。LC-MS和H-NMR結(jié)果證實了釋放的小分子化合物與之前報道的ADP加合(2-羥乙基)-4-甲基噻唑-2-羧酸(ADT)的分子量和結(jié)構(gòu)相一致,ADT是噻唑環(huán)的一種衍生物。而在生物體內(nèi),正是由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)這兩個獨立的環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合才生成硫胺素。采用成分簡單的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得了不結(jié)合該小分子化合的ActhiS蛋白,并利用該蛋白成功的進行了酶的體外催化反應(yīng),得到了上述的ADT產(chǎn)物。這證明了ActhiS蛋白是催化合成噻唑環(huán)的噻唑合成酶。通過定點突變,我們推測ActhiS中的Cys217為噻唑環(huán)提供硫來源,它是與其同源性蛋白THI4類似的一個自殺性酶。進一步探究硫胺素對CPC合成的影響。我們發(fā)現(xiàn)在頂頭孢霉發(fā)酵液中添加1mg/m L硫胺素可以提高CPC產(chǎn)量,繼續(xù)增大硫胺素濃度則抑制CPC的產(chǎn)量。同時研究了參與CPC的生物合成基因的轉(zhuǎn)錄差異,在頂頭孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1mg/m L和100mg/m L硫胺素,分別使得菌株中的cefEF,cefG轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)和下調(diào)。這說明硫胺素可以調(diào)節(jié)CPC合成的基因轉(zhuǎn)錄,進而影響到CPC的產(chǎn)量。同時,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫胺素對頂頭孢霉的菌絲體生長和生物量也有不同程度的影響。本研究首次證實了ActhiS蛋白是頂頭孢霉中的噻唑合成酶,其參與噻唑的合成,并進而影響到硫胺素的生成。硫胺素作為多種酶的輔酶,參與生物體內(nèi)氨基酸代謝和碳水化合物的代謝,并影響到到CPC的合成,說明硫胺素代謝途徑及Acthi基因可以作為CPC生產(chǎn)菌株育種的一個靶點。
[Abstract]:The main industrial producer of cephalosporin C, a 尾 -lactam antibiotic, is the filamentous fungus Cephalosporium. In recent years, the fermentation yield of cephalosporin C has been greatly increased. However, the molecular mechanism of metabolic differences between industrial and wild strains is still not clear. A comparative proteomics platform for high and low yield strains of Cephalosporium apocephalus was established in our laboratory. The protein ActhiS. the total RNA sequence of Cephalosporium was analyzed by Illumina sequence and the total cDNA sequence was obtained. The encoding gene Acthi. of ActhiS protein was found by preliminary sequence alignment. It was found that ActhiS was probably responsible for thiazole synthetase in the process of thiamine synthesis. It was proved that Acthi gene was involved in thiamine synthesis by constructing mutants of silencing and overexpression. And affect the synthesis of cephalosporin C. in this paper, ActhiS protein was further studied by biochemical method in vitro, including the following two aspects: first, the expression of recombinant bacteria in vitro. Purification of ActhiS protein, in vitro enzymatic catalysis, nuclear magnetic resonance (NMR) identification of the structure of the final product, and finally determine the function of ActhiS; Secondly, the effect of thiamine on the synthesis of CPC was studied. The main results were as follows: the activity of ActhiS protein was identified. It was found that the purified ActhiS protein expressed in LB medium could release small molecular compounds after thermal denaturation. LC-MS and H-NMR results confirmed that the released small molecular compounds were similar to those previously reported. ADP adduct. The molecular weight and structure of 2-hydroxyethyl-4-methylthiazole-2-carboxylic acid (ADT) were consistent. ADT is a derivative of thiazole ring. Thiamine was produced by the combination of pyrimidine ring and thiazolyl ring. The ActhiS protein which was not bound to this small molecule was obtained by using the simple M9 basic medium. The above ADT products were obtained by the catalytic reaction in vitro, which proved that ActhiS protein is a thiazole synthase that catalyzes the synthesis of thiazolyl ring, and by site-directed mutagenesis, it is proved that the ActhiS protein is a thiazole synthase that catalyzes the synthesis of thiazolyl ring. We speculate that Cys217 in ActhiS provides sulfur source for thiazole ring. It is a suicidal enzyme similar to its homologous protein THI4. To further explore the effect of thiamine on CPC synthesis, we found that 1 mg / m was added to the fermentation broth of Cephalosporium acrocephalus. L-thiamine could increase the yield of CPC. The production of CPC was inhibited by increasing the concentration of thiamine. The transcriptional differences of biosynthesis genes involved in CPC were also studied. 1 mg / mL and 100 mg / mL thiamine were added to the fermentation medium of Cephalosporium apocephalus, respectively, to make the cefEF in the strain. The up-regulation and down-regulation of cefG transcriptional level indicate that thiamine can regulate the transcription of genes synthesized by CPC and thus affect the production of CPC. The addition of thiamine in fermentation medium also affected the mycelium growth and biomass of Atracephalus to varying degrees. This study first confirmed that ActhiS protein is the thiazole synthase in Atracephalosporium. Thiamine is involved in the synthesis of thiazoles, which in turn affects the production of thiamine. As a coenzyme of many enzymes, thiamine is involved in the metabolism of amino acids and carbohydrates in organisms, and also in the synthesis of CPC. The results showed that thiamine metabolism pathway and Acthi gene could be used as a target for CPC producing strain breeding.
【學(xué)位授予單位】：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R915

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本文編號：1422707