本文關(guān)鍵詞：紫杉醇阿霉素共載藥膠束的制備及體內(nèi)外評價　出處：《山東大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：癌癥是目前影響人類健康的主要疾病之一。傳統(tǒng)化療藥物是臨床腫瘤治療的主體,但是,單一化療藥物由于生物利用度低、易產(chǎn)生多藥耐藥,臨床上多采用聯(lián)合用藥的方式。紫杉醇(Paclitaxel, PTX)是一類具有紫杉烷結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物,它能夠促進(jìn)微管的形成并抑制微管的解聚,阻礙細(xì)胞的正常分裂,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。臨床上常用來治療乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等。阿霉素(Doxorubicin, DOX)是一種蒽環(huán)類的抗腫瘤藥,它能夠嵌入到DNA分子的結(jié)構(gòu)中,使堿基對之間的距離增大,進(jìn)而引起DNA鏈的斷裂和結(jié)構(gòu)的破壞。臨床上適用于淋巴癌、乳腺癌、肺癌、急性白血病等。紫杉醇聯(lián)合阿霉素使用能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),提高治療效果。而且,由于這兩種化療藥物的作用機(jī)制不同,可在一定程度上預(yù)防多藥耐藥的產(chǎn)生,現(xiàn)已作為一線方案用于治療晚期乳腺癌。但是,由于阿霉素和紫杉醇兩種藥物的性質(zhì)有極大的不同,如何實(shí)現(xiàn)同時負(fù)載這兩種不同的藥物以及控制不同藥物同步釋放是研究者們目前面臨的最大困難和挑戰(zhàn)。本課題合成了具有pH敏感性的烏頭酸酐-阿霉素(CAD)分子,然后以普郎尼克F127-殼聚糖(F127-CS)為載體,構(gòu)建了F127-CS/CAD/PTX膠束,實(shí)現(xiàn)DOX與PTX的共遞送。并對該載藥膠束進(jìn)行體外體內(nèi)的相關(guān)評價,具體內(nèi)容如下：1.CAD的合成、表征及F127-CS聚合物取代度的測定：根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成了CAD,并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證。高效液相色譜圖顯示在保留時間6.15min和7.18min新出現(xiàn)了兩個色譜峰,其分別為合成產(chǎn)物CAD-1和CAD-2的色譜峰；在CAD紅外光譜圖上,3532.16cm-1和3334.54cm-1波長處伯氨基上氫原子的伸縮振動消失,而在3416.36cm-1波長處出現(xiàn)較強(qiáng)的單峰吸收,同時,在1647.06cm-1處出現(xiàn)酰胺鍵的羰基吸收峰；核磁共振圖譜顯示在6.05ppm和6.24ppm處出現(xiàn)-COCH=基團(tuán)上氫原子的特征位移。所有結(jié)果均顯示成功合成了CAD分子。采用三硝基苯磺酸法建立了游離氨基測定的方法,測得F127-CS聚合物氨基的取代度為：每1moL殼聚糖中平均有0.832±0.119個氨基被取代。2.共載藥膠束的制備及理化性質(zhì)的考察：本課題采用薄膜分散法制備了F127-CS/CAD/PTX共載藥膠束,并分別從載體材料與藥物質(zhì)量比、兩種藥物的質(zhì)量比、超聲時間以及超聲溫度四個方面對影響膠束載藥量的因素進(jìn)行考察,確定制備載藥膠束的最佳工藝。同時通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)篩選最佳藥物配比,當(dāng)阿霉素與紫杉醇的比例范圍為0.6-1時,兩種藥物協(xié)同效果最佳。通過透射電鏡觀察到膠束呈圓整球形,無粘連。膠束的粒徑為179.3nm,粒徑分布均勻, Zeta電位為2.37mV。芘熒光探針法測定膠束的臨界膠束濃度為0.039mg/mL。3.載藥膠束的體外釋放實(shí)驗(yàn)：采用透析袋法,以含0.5%的吐溫-80的pH5.0和pH7.4的檸檬酸緩沖液為釋放介質(zhì)考察載藥膠束在體外的釋放行為。結(jié)果顯示阿霉素和紫杉醇的釋放均呈現(xiàn)依賴pH的性質(zhì),pH越低藥物釋放的就越快,而且阿霉素的釋放速率要明顯快于紫杉醇。4.載藥膠束的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：以黑色素瘤B16細(xì)胞為模型,采用MTT法,考察F127-CS/CAD/PTX共載藥膠束和PTX+DOX混合溶液對腫瘤細(xì)胞的毒性作用。隨后采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)考察腫瘤細(xì)胞對F127-CS/CAD膠束和DOX溶液的攝取情況。結(jié)果顯示F127-CS/CAD/PTX膠束的1C50值小十DOX+PTX溶液,載藥膠束對腫瘤細(xì)胞的毒性高于混合溶液。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示與DOX溶液相比,F127-CS/CAD膠束更容易被細(xì)胞攝取。5.載藥膠束的體內(nèi)藥動力學(xué)實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動物,通過股靜脈給藥,于大鼠頸靜脈竇取血,考察F127-CS/CAD/PTX共載藥膠束和PTX+DOX混合溶液大鼠體內(nèi)的藥動力學(xué)特征。結(jié)果顯示混合溶液組中PTX和DOX的AUC(o-∞)值分別為2.628 mg/L*h和0.512 mg/L*h,而膠束組中PTX和DOX的AUC(o-∞)值分別為5.450 mg/L*h和1.081 mg/L*h,明顯高于混合溶液組。載藥膠束組中PTX的體內(nèi)半衰期(t1/2)為8.29h,比混合溶液中PTX的t1/2增加了4.5倍,載藥膠束中的DOX的t1/2比混合溶液中的也有所增加。將PTX和DOX包載于膠束中能降低其在體內(nèi)的清除率延長在體內(nèi)的時間。6.載藥膠束的體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)以B16細(xì)胞為模型建立荷瘤小鼠模型。通過尾靜脈注射給藥,以小鼠瘤體積變化及體重變化為指標(biāo),考察F127-CS/CAD/PTX共載藥膠束和PTX+DOX混合溶液對腫瘤的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示載藥膠束組和混合溶液組對小鼠腫瘤均具有較強(qiáng)的抑制作用,但是混合溶液組小鼠體重變化明顯,第14日,混合溶液組小鼠體重是生理鹽水組78.44%,毒性較大,而載藥膠束組小鼠體重?zé)o明顯變化,毒性較小。
[Abstract]:Cancer is one of the major diseases that affect human health. At present, traditional chemotherapy drugs is the main clinical treatment of tumors but single chemotherapy because of low bioavailability, easy to produce multi drug resistance, clinical use of combination therapy. Paclitaxel (Paclitaxel, PTX) is a kind of taxane anticancer structure the drug, which can promote microtubule formation and inhibit the depolymerization of microtubules, hinder the normal division of cells, and then inhibit the proliferation of tumor cells. Clinically to treat breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, non-small cell lung cancer. Adriamycin (Doxorubicin, DOX) is an anthracycline anticancer drug and it can be embedded into the molecular structure of DNA, the distance between the base pairs increases, which lead to fracture and the structure of the DNA chain destruction. Clinically applicable for lymphatic cancer, breast cancer, lung cancer, acute leukemia. Combined with paclitaxel The use of doxorubicin can produce synergistic effect, improve the therapeutic effect. Moreover, because the mechanism of these two kinds of chemotherapeutic drugs, to a certain extent, prevent the generation of multi drug resistance, has been used as a first-line chemotherapy for the treatment of advanced breast cancer. However, due to the nature of doxorubicin and paclitaxel two drugs are greatly different. How to realize the load of the two different drugs and different drug release synchronization is the biggest difficulty and challenge researchers are currently facing control. With the pH sensitivity of adriamycin - aconitic anhydride synthesis in this paper (CAD) molecules, then chitosan with Pluronic F127- shell (F127-CS) as the carrier, to construct the F127-CS/CAD/PTX micelles, CO delivery the realization of DOX and PTX. The correlation was evaluated in vitro and in vivo of the micelle, the specific contents are as follows: 1.CAD synthesis, characterization and determination of polymer from generation F127-CS: According to the synthesis of CAD document design, and validate its structure. HPLC showed that the retention time of 6.15min and 7.18min appeared two peaks, the peaks were synthesized CAD-1 and CAD-2; CAD in the infrared spectrum, 3532.16cm-1 and 3334.54cm-1 wavelength on primary amino hydrogen atom the stretching vibration disappeared, and at the 3416.36cm-1 wavelength of strong absorption peak appeared at 1647.06cm-1, at the same time, carbonyl amide absorption peak; NMR spectra showed the characteristics of hydrogen atom displacement on -COCH= group in 6.05ppm and 6.24ppm. All the results showed that CAD was successfully synthesized. The molecular method was established for determination of free amino groups using three trinitrobenzene sulfonic acid method, measured F127-CS polymer amino substitution: each chitosan in 1moL with an average of 0.832 + 0.119 amino substituted.2. micelle preparation Investigation and physicochemical properties: This study prepared by film dispersion method of F127-CS/CAD/PTX co micelles, and separately from the carrier material and drug quality ratio, quality of two kinds of drug ratio, ultrasonic time and ultrasonic temperature factors in four aspects of the effect of micellar drug loading for an investigation, to determine the optimum process for preparing drug at the same time. By micellar cytotoxicity screening the best drug ratio, when doxorubicin and paclitaxel ratio in the range of 0.6-1, two kinds of synergistic effect is the best. It was observed that the micelles showed spherical micelles, no adhesion. The diameter of 179.3nm, uniform particle size distribution, Zeta potential for critical micelle concentration determination of micellar 2.37mV. fluorescent probe method for drug loaded 0.039mg/mL.3. micelles in vitro release experiments using dialysis bag method, using citric acid buffer containing 0.5% -80 pH5.0 and Twain pH7.4 as the release medium Quality investigation of micelle dissolution behavior in vitro. The results showed that doxorubicin and paclitaxel release showed properties of pH dependent pH, lower drug release is faster, and the in vitro release rate of adriamycin is significantly faster than paclitaxel.4. micelles in melanoma B16 cells as a model and using the method of MTT toxicity on tumor cells of F127-CS/CAD/PTX micelles and PTX+DOX mixed solution. Then by fluorescence microscope and flow cytometry study of F127-CS/CAD micelles and DOX solution uptake of tumor cells. The results showed that F127-CS/CAD/PTX micelles 1C50 value ten DOX+PTX solution, the toxicity of the drug loaded micelles on tumor cells higher than that of the mixed solution. The cellular uptake test showed that compared with DOX solution, F127-CS/CAD micelles are more likely to be in vivo pharmacokinetic experiments of drug loaded cell uptake of.5. micelles: in this experiment, Wi Star rats as the experimental animal, administered through the femoral vein, venous sinus in the neck of blood in rats, to investigate the characteristics of pharmacokinetics in rats F127-CS/CAD/PTX drug loaded micelles and PTX+DOX mixed solution. The results show that mixed PTX and DOX solution in the AUC group (o- -) respectively 2.628 mg/L*h and 0.512 mg/L*h. While PTX and DOX micelles in the AUC group (o- -) values were 5.450 mg/L*h and 1.081 mg/L*h, was significantly higher than that of the mixed solution group. The drug loaded micelles in group PTX (t1/2) in vivo half-life of 8.29h, than in the mixed solution of PTX t1/2 increased by 4.5 times, the drug loaded micelles in DOX than t1/2 in the mixed solution is also increased. PTX and DOX will be loaded in the micelle can reduce the rate of extension in vivo in vivo.6. micelles the in vivo clearance: the experimental model of tumor bearing mice model with B16 cell. Administered by intravenous injection in mice The change of tumor volume and weight changes as the index, inhibition of PTX+DOX micelles and mixed solution of F127-CS/CAD/PTX drug on tumor were investigated. The experimental results show that the micelle solution group and mixed group has a strong inhibitory effect on tumor in mice, but the mixed solution of mice body weight change was fourteenth, the mixed solution of group body weight of mice is the saline group 78.44%, toxicity, and drug loaded micelles were without significant changes in body weight, less toxic.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943

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