本文關(guān)鍵詞：新型STAT3抑制劑K9抗多發(fā)性骨髓瘤的機理研究

  更多相關(guān)文章： K9 多發(fā)性骨髓瘤 JAK2 STAT3 白介素-6

【摘要】：目的:STAT3即信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3,是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)一系列基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子,在細胞凋亡和細胞周期等細胞生理過程中發(fā)揮著重要的作用。在多發(fā)性骨髓瘤中,STAT3被異常激活而失調(diào),同時與臨床上骨髓瘤病人的不良預(yù)后和耐藥密切相關(guān)。目前,靶向STAT3信號通路來設(shè)計相關(guān)STAT3抑制劑已成為抗骨髓瘤藥物研發(fā)的新策略之一。本研究旨在通過高通量篩選方法發(fā)現(xiàn)新的STAT3抑制劑,并闡釋其抗骨髓瘤的作用機制,為臨床上靶向藥物治療多發(fā)性骨髓瘤提供參考。方法:(1)利用基于熒光素酶報告基因的高通量篩選方法,從56,000個小分子化合物中尋找新型STAT3抑制劑。(2)通過Immunoblotting技術(shù)和流式細胞技術(shù),檢測K9對多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)細胞凋亡的影響。(3)通過構(gòu)建裸鼠腫瘤異體移植模型,分析K9對體內(nèi)腫瘤生長的影響。(4)使用Immunoblotting技術(shù),檢測K9對MM細胞本底以及IL-6所誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的影響;同時,通過MM細胞與骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)實驗,檢測K9對STAT3磷酸化的影響。(5)分別通過Immunoblotting技術(shù)、分子對接和體外酶活性測定方法,分析K9對STAT3上游各激酶活性的影響。(6)利用免疫共沉淀法和熒光素酶報告基因技術(shù),檢測K9對STAT3二聚化以及轉(zhuǎn)錄活性的影響。(7)RT-PCR和Immunoblotting技術(shù)分析K9對STAT3靶基因MCL1和XIAP轉(zhuǎn)錄表達的影響。(8)通過IL-6刺激實驗和STAT3過表達實驗,考察過度激活或過表達STAT3是否影響K9所誘導(dǎo)的MM細胞凋亡。(9)K9與阿霉素(DOX)進行聯(lián)合用藥,考察K9是否影響DOX的抗腫瘤活性。結(jié)果:(1)通過高通量篩選和前期實驗,發(fā)現(xiàn)化合物k9為候選的stat3抑制劑。(2)immunoblotting分析發(fā)現(xiàn),k9能夠促進mm細胞(nci-h929、kms12、oci-my5、rpmi-8226和u266)中凋亡相關(guān)蛋白parp和caspase3的剪切,進一步通過流式細胞分析技術(shù)發(fā)現(xiàn),k9能夠誘導(dǎo)mm細胞凋亡。(3)k9能夠抑制腫瘤異體移植模型中骨髓瘤的生長。同時,通過測定裸鼠體重發(fā)現(xiàn),給藥組與對照組體重沒有差別。另外,通過血液分析發(fā)現(xiàn),給藥組中wbc、rbc、hgb和plt與對照組相比無顯著差異,這些結(jié)果提示,k9在體內(nèi)的毒性較小。(4)stat3在5種mm細胞中異常激活。同時,k9能夠有效抑制mm細胞中本底或者il-6所誘導(dǎo)的stat3的活化,而對stat家族其它蛋白stat1和stat5的活化基本沒有影響。另外,mm細胞與骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)條件下,k9依然能夠抑制stat3的活化。(5)k9通過特異性抑制stat3信號通路上游激酶jak2的活化來抑制stat3信號通路,而對其它相關(guān)激酶的活化沒有影響,包括mtor、p38、erk和c-src等。另外,分子對接實驗發(fā)現(xiàn),k9能夠很好地結(jié)合到j(luò)ak2的活性口袋中,并能有效抑制jak2的活化。(6)k9能夠有效抑制stat3驅(qū)動的pstat3-luc熒光素酶活性,同時k9也能顯著抑制stat3下游靶基因ccnd2的啟動子活性,而對不含有stat3結(jié)合單元的熒光素酶活性沒有影響。另外,k9對另一重要的轉(zhuǎn)錄因子nfκb所驅(qū)動的熒光素酶活性也沒有影響。同時,co-ip結(jié)果顯示,k9能夠有效抑制stat3的二聚化。(7)rt-pcr和immunoblotting技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),k9顯著抑制stat3下游靶基因mcl1和xiap的轉(zhuǎn)錄表達。(8)il-6所誘導(dǎo)的stat3的活化能夠部分抑制k9所誘導(dǎo)的mm細胞的凋亡;同時,過表達stat3后發(fā)現(xiàn),其也能減弱k9對mm細胞的敏感性。(9)聯(lián)合用藥實驗發(fā)現(xiàn),k9能夠促進dox的抗mm活性。結(jié)論:在體內(nèi)和體外實驗中,k9都表現(xiàn)出較強的抗mm活性,并且其體內(nèi)毒性比較低。同時,k9通過特異性抑制jak2/stat3信號通路來調(diào)控細胞凋亡和細胞周期進程,進而抑制mm細胞存活。k9可作為一種新型stat3抑制劑,希望本文能為開發(fā)新型抗MM藥物提供參考。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：1284309