發(fā)布時間：2017-11-28 07:32

  本文關鍵詞：GPCR信號通路研究模型的建立與應用及孤兒受體的藥物篩選

  更多相關文章： GPCRs β-arrestin1/2 ELuc 蛋白-蛋白相互作用 偏向性激動劑 GPR85 GPR98 高通量篩選

【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)主要通過激活G蛋白調節(jié)下游信號,從而參與某些生理病理反應,而β-arrestin作為細胞內的一種重要骨架蛋白,在絕大部分GPCR介導的信號轉導中具有重要調節(jié)作用,調控GPCR脫敏、內吞、細胞增殖和基因轉錄,因此通過研究GPCR與β-arrestin的相互作用來研究GPCR介導的β-arrestin信號通路顯得非常必要。本文通過構建叩頭蟲熒光素酶(Brazilian Cratomorphus distinctus;Emerald Luc;ELuc)片段分別與AGTR1(β2AR,GCGR)和β-arrestin1/2融合表達質粒,其N端(1-415 aa)與β-arrestin1/2 N端融合(ELucN-β-arrestin1/2),C端(394-542 aa)與AGTR1(β2AR,GCGR)C端融合(AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC),瞬轉至HEK293細胞中,分別采用Western blot、免疫熒光染色及鈣流實驗,驗證融合表達質粒在HEK293細胞中的表達及其生物學活性,然后共轉AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC和ELucN-β-arrestin1/2至HEK293細胞中,通過對細胞轉染條件的優(yōu)化以及化合物刺激時間的研究,檢測在配體刺激下AGTR1(β2AR,GCGR)與β-arrestin1/2相互作用情況,并利用該檢測模型對已報道的AGTR1、β2AR的偏向性激動劑進行驗證。研究發(fā)現(xiàn),在該模型檢測下Angiotensin-2、Isoproterenol分別能夠劑量依賴性的引起AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用的改變,同時對于偏向性激動劑的驗證中,只有Angiotensin-2能激活AGTR1介導的Gq信號通路,而Angiotensin-2、S-2、TRV120023均能劑量依賴性增強AGTR1與β-arrestin1/2相互作用,Isoetharine、Ethylnorepinephrine在激活β2AR時更偏向于β-arrestin1/2信號通路,這些結果均與文獻報道相符,表明我們成功地構建了AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用檢測模型,而且該模型可靠、準確,為GPCR信號轉導通路及其偏向性激動劑研究奠定了良好的基礎。此外,我們按照相同的方式利用ELuc片段互補分析建立了β2AR與G蛋白相互作用檢測模型,研究了β2AR與Gα16相互作用情況,并結合免疫共沉淀的結果,我們得知在β2AR激活時,β2AR與Gα16和Gαs的相互作用并未發(fā)生顯著性改變。本論文的第二部分為利用cAMP實驗構建孤兒受體GPR85、GPR98小分子配體的高通量篩選模型,并利用國家新藥篩選中心化合物展開大規(guī)模隨機篩選,從總共篩選的10萬個化合物中,我們得到了8個在GPR98上具有一定活性的化合物,我們將進一步進行相關的研究。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1233216