本文關(guān)鍵詞：GPCR信號(hào)通路研究模型的建立與應(yīng)用及孤兒受體的藥物篩選

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【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)主要通過激活G蛋白調(diào)節(jié)下游信號(hào),從而參與某些生理病理反應(yīng),而β-arrestin作為細(xì)胞內(nèi)的一種重要骨架蛋白,在絕大部分GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要調(diào)節(jié)作用,調(diào)控GPCR脫敏、內(nèi)吞、細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄,因此通過研究GPCR與β-arrestin的相互作用來研究GPCR介導(dǎo)的β-arrestin信號(hào)通路顯得非常必要。本文通過構(gòu)建叩頭蟲熒光素酶(Brazilian Cratomorphus distinctus;Emerald Luc;ELuc)片段分別與AGTR1(β2AR,GCGR)和β-arrestin1/2融合表達(dá)質(zhì)粒,其N端(1-415 aa)與β-arrestin1/2 N端融合(ELucN-β-arrestin1/2),C端(394-542 aa)與AGTR1(β2AR,GCGR)C端融合(AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC),瞬轉(zhuǎn)至HEK293細(xì)胞中,分別采用Western blot、免疫熒光染色及鈣流實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證融合表達(dá)質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)活性,然后共轉(zhuǎn)AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC和ELucN-β-arrestin1/2至HEK293細(xì)胞中,通過對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化以及化合物刺激時(shí)間的研究,檢測(cè)在配體刺激下AGTR1(β2AR,GCGR)與β-arrestin1/2相互作用情況,并利用該檢測(cè)模型對(duì)已報(bào)道的AGTR1、β2AR的偏向性激動(dòng)劑進(jìn)行驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn),在該模型檢測(cè)下Angiotensin-2、Isoproterenol分別能夠劑量依賴性的引起AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用的改變,同時(shí)對(duì)于偏向性激動(dòng)劑的驗(yàn)證中,只有Angiotensin-2能激活A(yù)GTR1介導(dǎo)的Gq信號(hào)通路,而Angiotensin-2、S-2、TRV120023均能劑量依賴性增強(qiáng)AGTR1與β-arrestin1/2相互作用,Isoetharine、Ethylnorepinephrine在激活β2AR時(shí)更偏向于β-arrestin1/2信號(hào)通路,這些結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道相符,表明我們成功地構(gòu)建了AGTR1、β2AR與β-arrestin1/2相互作用檢測(cè)模型,而且該模型可靠、準(zhǔn)確,為GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其偏向性激動(dòng)劑研究奠定了良好的基礎(chǔ)。此外,我們按照相同的方式利用ELuc片段互補(bǔ)分析建立了β2AR與G蛋白相互作用檢測(cè)模型,研究了β2AR與Gα16相互作用情況,并結(jié)合免疫共沉淀的結(jié)果,我們得知在β2AR激活時(shí),β2AR與Gα16和Gαs的相互作用并未發(fā)生顯著性改變。本論文的第二部分為利用cAMP實(shí)驗(yàn)構(gòu)建孤兒受體GPR85、GPR98小分子配體的高通量篩選模型,并利用國(guó)家新藥篩選中心化合物展開大規(guī)模隨機(jī)篩選,從總共篩選的10萬個(gè)化合物中,我們得到了8個(gè)在GPR98上具有一定活性的化合物,我們將進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的研究。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R91

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號(hào)：1233216