本文關(guān)鍵詞：以Neprilysin為靶點(diǎn)的藥物篩選模型的建立及應(yīng)用

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【摘要】：盡管現(xiàn)在的醫(yī)療診斷和管理水平都有顯著提高,但全球人民的健康和心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)尤其是高血壓和心力衰竭造成的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)在心力衰竭動(dòng)物模型中,腎臟中的Neprilysin(NEP)蛋白含量增加,活性及表達(dá)上調(diào)。NEP (EC 3.4.24.11)是中性內(nèi)肽酶,也稱腦啡肽酶,是一種位于細(xì)胞膜表面的Ⅱ型含鋅跨膜金屬蛋白酶,主要的生理功能是水解肽鏈氨基端疏水氨基酸殘基。NEP對(duì)調(diào)節(jié)血壓的肽類物質(zhì),如利鈉肽(natriuretic peptide, NP),緩激肽(Bradykinin, BK),內(nèi)皮素等具有降解作用,抑制NEP能增加這些血管活性肽的活性,因此NEP成為治療心血管疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本課題主要目的是通過(guò)建立以NEP為靶標(biāo)的高通量篩選模型,并應(yīng)用該模型篩選可以作為先導(dǎo)化合物的抑制劑。利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZα-A-NEP,表達(dá)載體通過(guò)與酵母菌X-33基因組染色體發(fā)生同源重組,將外源基因整合于染色體后實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá),表達(dá)的蛋白通過(guò)Ni2+-NTA親和層析進(jìn)行分離純化,以此得到純度較高的NEP目的蛋白。應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)檢測(cè)蛋白酶活性,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立藥物篩選體系。應(yīng)用建立的藥物篩選體系篩選了784種化合物和2000種天然產(chǎn)物分段組分,篩選到2種抑制效果較好的化合物,并測(cè)定了這2種化合物的ICso值,其中編號(hào)為MDCR02的ICso為101.3 μmol/L,編號(hào)為MDCR04的ICso為0.494 μmol/L;篩選到8種抑制率大于90%的天然產(chǎn)物分段組分,通過(guò)進(jìn)行梯度稀釋比較抑制效果,最后得到兩種抑制效果相對(duì)較好的組分,分別是MDCNCL01000241, MDCNCL01000242, IC50值均在10μg/mL以下。這些先導(dǎo)藥物的發(fā)現(xiàn)有助于針對(duì)NEP開發(fā)新藥。
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：1208095