本文關(guān)鍵詞：鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A增強氟康唑抗生物膜型白念珠菌的研究

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【摘要】：目的本研究旨在評價鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A(cyclosporine,CSA)對氟康唑抗生物膜型白念珠菌的增敏作用,并初步探討其增敏作用的可能機制。方法收集2014年1-12月從寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床血流感染標(biāo)本中分離出的白念珠菌,采用法國梅里埃公司全自動微生物分析儀(VITEK 2 COMPACT)將微生物鑒定到“種”水平。選取從臨床血流感染分離的強產(chǎn)膜菌株CA NX05作為實驗菌株,構(gòu)建體外生物膜模型,并分析其生長動力學(xué)情況,明確菌株生長的對數(shù)期;采用熒光染色法定性觀察生物膜的生長及形態(tài),XTT法測定藥物對生物膜型白念珠菌細胞活性的影響,并利用實時熒光定量q RT-PCR檢測耐藥及粘附相關(guān)基因ALS3、HWP1、CDR1、MDR及ERG11在m RNA表達水平的變化;利用水-烴兩相分離實驗檢測藥物對細胞表面相對疏水性的影響;利用流式細胞儀測定藥物對細胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響。結(jié)果2014年1-12月從寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床血流感染標(biāo)本中共分離出白念珠菌24株,其中4株強產(chǎn)膜菌株、6株中產(chǎn)膜菌株、14株弱產(chǎn)膜菌株,并將其中從臨床血流感染中分離獲得的強產(chǎn)生物膜型白念珠菌,命名為CA NX05(OD值最大);用顯微鏡觀察結(jié)晶紫染色后的弱產(chǎn)膜株,發(fā)現(xiàn)大部分細胞以酵母樣粘附于培養(yǎng)板底部,并且形成微菌落,只有少量成菌絲樣細胞生長。觀察CA NX05強產(chǎn)膜株時發(fā)現(xiàn),大部分細胞是以菌絲樣生長,菌絲相互交錯生長,依稀能看見基底的酵母樣細胞。動力學(xué)實驗表明4-18h是菌株生長的對數(shù)增長期,當(dāng)培養(yǎng)到24-48h時處于穩(wěn)定期。根據(jù)棋盤法藥敏實驗結(jié)果提示,單用CSA對白念珠菌生物膜的抑制率很低,當(dāng)濃度達到300μg/ml時抑制率仍小于10%。當(dāng)單用FLC時,雖然抑制率有所升高,但是當(dāng)濃度達到1024μg/ml時,真菌生長抑制率小于20%,與無處理組相比,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。然而當(dāng)用濃度為75μg/ml的CSA與FLC聯(lián)合使用時,FLC的MIC50為32μg/ml,相對于單用藥降低了32倍之多,與單用FLC相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。q RT-PCR檢測結(jié)果顯示當(dāng)FLC和CSA聯(lián)合使用時其耐藥泵基因和粘附相關(guān)基因ALS3、MDR、CDR1、ERG11、HWP1的表達量與它們單獨作用相比明顯降低(P0.05);利用水-烴兩相分離實驗檢測藥物對細胞表面相對疏水性時,發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入鈣調(diào)磷酸酶抑制劑后與單用氟康唑相比,其疏水性相對降低;采用流式細胞儀檢測其胞內(nèi)鈣離子的濃度變化時,發(fā)現(xiàn)氟康唑加入以后,與沒有加入藥物相比其細胞內(nèi)鈣離子濃度變化很小,而加入抑制劑環(huán)孢菌素A以后隨時間的增加其胞內(nèi)鈣離子逐漸增多,差異有顯著性意義(P0.05)。結(jié)論1.白念珠菌在細胞培養(yǎng)板上能夠形成典型的生物膜,通過熒光顯微鏡可以看到白念珠菌生物膜隨著時間的增長其細胞數(shù)量和細胞外多糖基質(zhì)也逐漸增多,48h以后能夠形成典型的生物膜結(jié)構(gòu)。2.生物膜型白念珠菌隨著其不斷地成熟對氟康唑的耐藥性不斷地增強,而加入鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A能夠增強氟康唑抗生物膜型白念珠菌的敏感性。3.鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A對氟康唑抗生物膜型白念珠菌的增敏作用機制可能與降低耐藥及粘附相關(guān)基因的表達量、降低細胞表面的疏水性及增加胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：白念珠菌 生物膜 鈣調(diào)磷酸酶 氟康唑 耐藥基因
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文縮略語9-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-29
• 1.材料14-15
• 2.方法15-28
• 3.統(tǒng)計學(xué)分析28-29
• 結(jié)果29-40
• 討論40-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-54
• 文獻綜述54-67
• 綜述參考文獻61-67
• 致謝67-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68-69
• 個人簡歷69

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本文編號：1114797