本文關(guān)鍵詞：重組人干擾素α-2b的新型制備方法及其長效制劑研究

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【摘要】：干擾素是單核細(xì)胞分泌的具有高活性、多生物功能的細(xì)胞因子。自從1957年IFN被發(fā)現(xiàn)至今,對IFN的研究和產(chǎn)品研發(fā)一直在持續(xù)。干擾素在抗病毒、抗腫瘤以及在免疫調(diào)節(jié)中起到至關(guān)重要的作用。IFNα-2b是IFN大家族中最早被發(fā)現(xiàn)的亞型之一;也是臨床治療中應(yīng)用最廣泛的品種之一,在眾多類型的干擾素中,IFNα-2b的抗病毒、抗腫瘤、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力最強(qiáng),因此,IFNα-2b在多種疾病治療中發(fā)揮不可替代的作用。目前,大多數(shù)醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)的IFNα-2b制備方式仍沿用包涵體變復(fù)性的形式,盡管,隨著生產(chǎn)水平的提高其復(fù)性率有所增加,但產(chǎn)品中依然殘存無活性的錯配體,導(dǎo)致產(chǎn)品活性較低,藥品質(zhì)量存在嚴(yán)重缺陷。擁有諸多生物活性的rhIFN,在臨床應(yīng)用中有著極其重要地位,尤其是在乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病和卡波其肉瘤、惡性黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤等癌癥治療中起到重要作用,但rhIFN也存在其他生物藥劑的通病:即副作用大;半衰期短;容易產(chǎn)生中和抗體等弊端。因此,對它進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和修飾的研究仍在繼續(xù)。長效干擾素作為干擾素的衍化產(chǎn)物,是利用點(diǎn)擊化學(xué)的理論,通過有機(jī)化學(xué)中各種反應(yīng),使干擾素中游離的基團(tuán)與無毒無害無刺激的PEG進(jìn)行偶聯(lián)得到的復(fù)合產(chǎn)物。偶聯(lián)后的長效干擾素?fù)碛懈蓴_素的眾多優(yōu)點(diǎn),并且具有更大的分子量,更長半衰期;盡管PEG的加入使得干擾素的生物學(xué)活性有所降低,但降低了它的副作用并減少了中和抗體的產(chǎn)生。本實驗針對干擾素IFNα-2b在原核生物中只能以包涵體形式表達(dá)的現(xiàn)狀,利用基因工程將其進(jìn)行改造,添加分子伴侶TrxA、Smt3等,使其能夠達(dá)到可溶性表達(dá)的目的,并利用簡便的純化技術(shù),使用高效SUMO酶等試劑將其提純。對純化的干擾素蛋白使用單甲氧基化的mPEG-SPA20000進(jìn)行定點(diǎn)修飾。以極其簡便的純化步驟及方式將單偶聯(lián)聚乙二醇的干擾素mPEG-IFNα-2b提純出來。最后,利用高壓液相色譜以及體外活性實驗對其純度及生物活性進(jìn)行檢驗。實驗內(nèi)容I:利用多分子伴侶表達(dá)載體在大腸埃希氏菌中融合表達(dá)人干擾素IFNα-2b,并進(jìn)行IFNα-2b純化工藝的研究;使用細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒酶切與連接、菌體誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化等技術(shù),將人工設(shè)計并合成Smt3-IFNα-2b克隆至自行構(gòu)建的P32-TrxA載體中,將重組表達(dá)質(zhì)粒P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(E.coil)BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE分析,表明IFNα-2b呈可溶性表達(dá)形式存在,在此基礎(chǔ)之上再利用諸多層析方法:MCAC技術(shù)、SUMO蛋白酶酶切、IEC技術(shù)以及GFC層析技術(shù)等提純了干擾素IFNα-2b,并建立了以IFNα-2b可溶性表達(dá)形式為基礎(chǔ)的全新制備工藝。實驗內(nèi)容II:利用第二代聚乙二醇對IFN的定點(diǎn)修飾的特點(diǎn),在反應(yīng)中得到單聚乙二醇修飾的長效干擾素,并進(jìn)行mPEG-IFNα-2b純化工藝的探索;根據(jù)對本實驗中涉及的干擾素IFNα-2b、聚乙二醇性質(zhì)的報道的研究,選用mPEG-SPA20000對其進(jìn)行偶聯(lián),使用生物學(xué)統(tǒng)計軟件,對聚乙二醇與干擾素偶聯(lián)實驗條件進(jìn)行5因素4水平的正交試驗設(shè)計,選取最佳的偶聯(lián)反應(yīng)條件,進(jìn)行試驗。通過使用各種層析方式,如:MCAC技術(shù)、AC技術(shù)、以及GFC技術(shù),獲得了純度高、生物活性較好的單聚乙二醇偶聯(lián)的干擾素mPEG-IFNα-2b,形成了較系統(tǒng)的mPEG-IFNα-2b純化工藝。實驗內(nèi)容III:利用干擾素及長效干擾素的抗病毒、抗腫瘤特性,對人羊膜細(xì)胞及各種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外生物活性研究;使用Lowry試劑法及BSA試劑法測定兩種蛋白濃度,使用高效液相色譜對兩種干擾素進(jìn)行純度測定,并且使用含10%FBS的RPMI1640和10%FBS的DMEM透析后過濾除菌,依照《中華人民共和國藥典》(2015版)對其進(jìn)行細(xì)胞病變抑制實驗,測得兩種干擾素的抗病毒活性,并通過體外細(xì)胞實驗,檢測兩種干擾素對不同腫瘤細(xì)胞的抑制和殺滅效果。
【關(guān)鍵詞】：干擾素 長效干擾素 蛋白純化 定點(diǎn)修飾 高效液相色譜
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-11
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述11-22
• 第一章 干擾素11-17
• 1.1 干擾素的定義及發(fā)展史11-12
• 1.2 干擾素的種類12
• 1.3 干擾素的結(jié)構(gòu)12
• 1.4 干擾素的理化性質(zhì)12-13
• 1.5 干擾素的生物活性13-14
• 1.5.1 抗病毒13-14
• 1.5.2 抗腫瘤14
• 1.6 干擾素IFNα-2b14-16
• 1.7 臨床醫(yī)療中應(yīng)用16
• 1.8 干擾素優(yōu)點(diǎn)及不足16-17
• 第二章 長效干擾素17-22
• 2.1 長效干擾素種類17
• 2.2 點(diǎn)擊化學(xué)17
• 2.3 mPEG和mPEG-SPA2000017-18
• 2.4 長效干擾素mPEG-IFN18-19
• 2.5 長效干擾素的理化性質(zhì)及生物活性19
• 2.6 臨床中的應(yīng)用及發(fā)展前景19-22
• 第二篇 研究內(nèi)容22-49
• 第一章 P32-TrxA- Smt3-IFNα-2b基因構(gòu)建表達(dá)及純化22-32
• 1.1 試驗材料22-24
• 1.1.1 儀器22
• 1.1.2 主要試劑22-23
• 1.1.3 預(yù)溶液的配制23-24
• 1.2 試驗方法24-27
• 1.2.1 重組P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b質(zhì)粒的構(gòu)建24-25
• 1.2.2 工程菌P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b/ BL21（DE3）的制備與誘導(dǎo)表達(dá)25-26
• 1.2.3 融合蛋白P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b的純化26
• 1.2.4 重組人干擾素IFNα-2b的純度檢測26-27
• 1.3 結(jié)果27-31
• 1.3.1 P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b基因片段的酶切與回收27
• 1.3.2 重組載體P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b的酶切鑒定27-28
• 1.3.3 融合蛋白TrxA-Smt3-IFNα-2b的表達(dá)28
• 1.3.4 融合蛋白TrxA-Smt3-IFNα-2b的粗純化28-30
• 1.3.5 融合蛋白的精度純化30
• 1.3.6 高效液相色譜濃度鑒定30-31
• 1.4 討論31
• 1.5 小結(jié)31-32
• 第二章 長效干擾素mPEG-IFNα-2b制備32-41
• 2.1 實驗材料32-33
• 2.1.1 主要儀器32
• 2.1.2 主要試劑32-33
• 2.1.3 試劑配制33
• 2.2 實驗方案33-36
• 2.2.1 長效干擾素mPEG-IFNα-2b的制備33-34
• 2.2.2 單甲基化的長效干擾素mPEG-IFNα-2b的純化34-35
• 2.2.3 單甲基化的長效干擾素mPEG-IFNα-2b純度檢測35-36
• 2.3 結(jié)果36-39
• 2.3.1 長效干擾素mPEG-IFNα-2b正交試驗結(jié)果36-38
• 2.3.2 單甲基化的長效干擾素mPEG-IFNα-2b的純化38-39
• 2.3.3 長效干擾素mPEG-IFNα-2b的反向高效液相色譜39
• 2.4 討論39-40
• 2.5 小結(jié)40-41
• 第三章 兩種干擾素的體外生物活性的研究41-49
• 3.1 試驗材料41-42
• 3.1.1 材料41
• 3.1.2 主要儀器41
• 3.1.3 主要試劑41-42
• 3.2 試驗方法42-45
• 3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇42
• 3.2.2 細(xì)胞鋪板42-43
• 3.2.3 兩種干擾素的體外抗腫瘤細(xì)胞實驗43
• 3.2.4 兩種干擾素的體外抗病毒實驗43-45
• 3.3 結(jié)果45-47
• 3.3.1 兩種干擾素作用于Hela細(xì)胞效果45
• 3.3.2 兩種干擾素作用于Hep-2 細(xì)胞效果45-46
• 3.3.3 兩種干擾素作用于Ishikawa細(xì)胞效果46
• 3.3.4 兩種干擾素作用于BGC細(xì)胞效果46
• 3.3.5 兩種干擾素作用于Wish細(xì)胞效果46-47
• 3.3.6 兩種干擾素作用于 Wish-VSV 系統(tǒng)蛋白效價47
• 3.4 討論47-48
• 3.5 小結(jié)48-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊宇峰;路煜;石瑋;馬相虎;秦潔;朱威;樓覺人;;聚乙二醇修飾重組人干擾素α1b的制備及其性質(zhì)[J];中國生物制品學(xué)雜志;2010年06期

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本文編號：1082463