本文關(guān)鍵詞：EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向siRNA脂多胺修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)動(dòng)態(tài)與藥效學(xué)評(píng)價(jià)

  更多相關(guān)文章： EGFR受體 survivin-siRNA MRP1-siRNA 荷正電類脂質(zhì) 肺部吸入

【摘要】：目的：構(gòu)建EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向survivin siRNA和MRP1 siRNA共負(fù)載脂多胺修飾脂質(zhì)體(EGFR-PEG-NCLs-siRNA),評(píng)價(jià)其制劑學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)、體內(nèi)組織分布以及與順鉑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果。方法：首先,通過(guò)置換和酰胺化反應(yīng)合成類脂質(zhì)陽(yáng)離子載體材料N,N'-二油酰三羥甲基氨基甲烷(2-氨基乙基)胺(N,N'-dioleoyl tris (2-aminoethyl) amine, NDOA),并合成聚乙二醇(PEG)馬來(lái)酸嫁接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DEPE)。通過(guò)硅膠薄層色譜法(TLC)、傅里葉紅外光譜法(FT-IR)和核磁共振法(1H-NMR)等對(duì)上述合成產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。采用乙醇注入法制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體,并測(cè)定其粒徑,Zeta電位和FAM-siRNA的包封率。以人源非小細(xì)胞肺腺癌A549細(xì)胞和耐順鉑株A549/DDP細(xì)胞為模型,以MTT法考察空白長(zhǎng)循環(huán)陽(yáng)離子脂質(zhì)體(PEG-NCLs)對(duì)A549與A549/DDP細(xì)胞的安全性。采用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry, FCM)和激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope, CLSM)考察A549/DDP細(xì)胞對(duì)EGFR-PEG-NCLs的攝取及其從A549/DDP細(xì)胞溶酶體中的逃逸。采用FCM考察EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的凋亡。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)考察EGFR-PEG-NCLs-survivin/MRP1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞的基因沉默。噴霧冷凍干燥法將脂質(zhì)體制成微粉供肺部干粉吸入給藥。以帶綠色熒光的人源性肺腺癌細(xì)胞株Luc-A549建立裸鼠原位肺癌模型,用小動(dòng)物活體成像儀考察負(fù)載siRNA的脂質(zhì)體通過(guò)肺部吸入與尾靜脈注射給藥時(shí)在體內(nèi)各組織器官分布情況；并考察負(fù)載survivin siRNA和MRP1 siRNA的脂質(zhì)體與順鉑聯(lián)用時(shí)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。最后,通過(guò)蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin staining, HE)考察給藥對(duì)各組織器官的影響。結(jié)果：經(jīng)TLC,1H-NMR和FT-IR法驗(yàn)證了陽(yáng)離子載體材料NDOA的成功制備,其純度為87%；DSPE-PEG2000-Mal經(jīng)TLC和1H-NMR法驗(yàn)證產(chǎn)物合成,其純度為86.2%。PEG-NCLs的粒徑為(193.2±3.4)nm,Zeta-電位為(7.9 ± 0.1)mV, FAM-siRNA的包封率為(91.9±0.8)%。TEM圖結(jié)果顯示,所制得脂質(zhì)體粒度均勻,顆粒圓整,分散性良好。攝取結(jié)果表明,EGFR靶向可以明顯提高A549/DDP細(xì)胞對(duì)PEG-NCLs的攝取能力,其攝取能力是未經(jīng)EGFR修飾的1.4倍。CLSM結(jié)果顯示,EGFR-PEG-NCLs-siRNA可從A549/DDP細(xì)胞的溶酶體中成功逃逸EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA組的凋亡率為(41.14±1.68)%,約為L(zhǎng)ipofectamine-2000組(19.86±1.30)%的2倍。EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA的基因沉默率為(96.7±1.2)%,EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA的基因沉默率為(50.0±16.1)%,均有良好的基因沉默效果。此外,EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA和EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞后,A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性提高。體內(nèi)組織分布結(jié)果顯示,脂質(zhì)體通過(guò)肺部吸入相對(duì)于尾靜脈注射在肺部停留時(shí)間久,并且靶向性較好。抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,順鉑(DDP)與EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA與EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA聯(lián)合給藥具有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。HE染色結(jié)果表明,DDP與EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA與EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA聯(lián)合給藥對(duì)腫瘤的殺傷能力最強(qiáng),且不會(huì)對(duì)各組織器官造成損傷,安全性較好。結(jié)論：本文制備的EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向siRNA脂多修飾脂質(zhì)體(EGFR-PEG-NCLs-siRNA)粒徑均一,顆粒圓整,分散性和穩(wěn)定性較好,EGFR靶向顯著提高細(xì)胞攝取率,并且可以成功的從溶酶體中逃逸出來(lái)。它能很好地轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA,與順鉑聯(lián)合用藥可以發(fā)揮良好的體內(nèi)外殺傷非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞作用。
【關(guān)鍵詞】：EGFR受體 survivin-siRNA MRP1-siRNA 荷正電類脂質(zhì) 肺部吸入
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-19
• 1 RNA干擾12-14
• 1.1 RNA干擾的起源12
• 1.2 siRNA在肺部遞送的障礙12-14
• 2 SIRNA在治療肺部疾病的給藥途徑14-15
• 3 肺部疾病模型15-16
• 4 臨床研究進(jìn)展16-17
• 5 展望17
• 6 本研究的立題依據(jù)和目的17-19
• 第二章 陽(yáng)離子脂質(zhì)材料NDOA的合成及表征19-28
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器19-20
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-22
• 2.1 NDOA的合成20-21
• 2.2 DSPE-PEG_(2000)-Mal的合成21-22
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論22-27
• 3.1 油酸三氟乙酯的表征22-24
• 3.2 NDOA的表征24-26
• 3.3 DSPE-PEG_(2000)-Mal的表征26-27
• 4 本章小結(jié)27-28
• 第三章 EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向siRNA脂質(zhì)體的制備28-34
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器28-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 2 溶液配制29
• 3 實(shí)驗(yàn)方法29-31
• 3.1 FAM-siRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制29
• 3.2 PEG修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備29
• 3.3 Anti-EGFR mAb的巰基化29-30
• 3.4 EGFR靶向負(fù)載siRNA的脂質(zhì)體的制備30
• 3.5 粒徑及電位的測(cè)定30
• 3.6 脂質(zhì)體的表征30
• 3.7 包封率的測(cè)定30
• 3.8 負(fù)載siRNA脂質(zhì)體的N/P30-31
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論31-33
• 4.1 FAM-siRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線31
• 4.2 脂質(zhì)體的制備與表征31-33
• 5 本章小結(jié)33-34
• 第四章 陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞攝取、定位及藥效學(xué)評(píng)價(jià)34-50
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器34-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器35
• 2 溶液配制35
• 3 實(shí)驗(yàn)方法35-39
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)35
• 3.2 細(xì)胞毒性35-36
• 3.3 細(xì)胞攝取36-37
• 3.4 溶酶體逃逸37
• 3.5 細(xì)胞凋亡37
• 3.6 RT-PCR檢測(cè)survivin基因和MRP1基因mRNA的表達(dá)37-38
• 3.7 體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)38-39
• 3.8 數(shù)據(jù)的分析39
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-49
• 4.1 細(xì)胞毒性39-40
• 4.2 細(xì)胞攝取40-42
• 4.3 溶酶體逃逸42-43
• 4.5 細(xì)胞凋亡43-45
• 4.6 RT-PCR測(cè)定survivin基因和MRP1基因中mRNA的表達(dá)45-46
• 4.7 細(xì)胞藥效學(xué)評(píng)價(jià)46-49
• 5 本章小結(jié)49-50
• 第五章 EGFR-PEG-NCLS-ICG干粉吸入劑的制備與評(píng)價(jià)50-56
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器50
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料50
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器50
• 2 實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 2.1 EGFR-PEG-NCLs-ICG干粉吸入劑的制備50-51
• 2.2 粉末形態(tài)51
• 2.3 X-射線衍射51
• 2.4 引濕性51
• 2.5 排空率51
• 2.6 體內(nèi)組織分布51-52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論52-55
• 3.1 微粉的粒度分布52
• 3.2 粉末形態(tài)52-53
• 3.3 X-射線衍射53-54
• 3.4 排空率54
• 3.5 引濕性54-55
• 3.6 體內(nèi)組織分布55
• 4. 本章小結(jié)55-56
• 第六章 EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向siRNA脂多胺修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)評(píng)價(jià)56-65
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器56-57
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料56
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器56-57
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物57
• 2 溶液配制57
• 3 實(shí)驗(yàn)方法57-58
• 3.1 肺癌原位模型的建立57
• 3.2 肺癌原位模型的活體熒光成像57
• 3.3 肺癌原位模型離體器官成像及組織分布研究57-58
• 3.4 體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)58
• 3.5 離體組織H&E染色58
• 3.6 數(shù)據(jù)的分析58
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論58-64
• 4.1 近紅外熒光成像58-60
• 4.2 離體組織分布60-62
• 4.3 抗腫瘤效果62-63
• 4.4 離體組織H&E染色63-64
• 5 小結(jié)64-65
• 全文總結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 秦宏陽(yáng);羅玉均;張得玉;馮春復(fù);何逸民;張桂紅;;2型豬圓環(huán)病毒感染對(duì)小鼠組織中Caspase3、Bak及Bcl-2基因表達(dá)的影響[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年05期

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本文編號(hào)：1075845