本文關(guān)鍵詞：新福林和貝特舒對人角膜基質(zhì)細胞凋亡誘導(dǎo)作用的實驗研究

  更多相關(guān)文章： 新福林 貝特舒 人角膜基質(zhì)細胞 細胞凋亡

【摘要】：隨著全球人口老齡化進程的加劇,受到青光眼等眼部疾病困擾的患者越來越多,其相應(yīng)的治療藥物在眼科臨床中得到了廣泛應(yīng)用。而眼表直接給藥的方式易導(dǎo)致藥物被角膜吸收而引起角膜損傷,主要是通過作用于角膜細胞引起的。人角膜基質(zhì)細胞(Human corneal stromal cells,HCS細胞)在靠近前彈力層處分布較多,對維持角膜的正常結(jié)構(gòu)和生理功能起關(guān)鍵作用,因此研究眼科藥物對HCS細胞的影響作用對眼科藥物的臨床安全應(yīng)用、低毒藥物篩選體系的建立以及新型無毒眼科藥物的研發(fā)具有重要的應(yīng)用價值和科學(xué)意義。截止到目前,關(guān)于擴瞳用擬腎上腺素藥新福林和治療青光眼用抗腎上腺素藥貝特舒對HCS細胞的毒性作用尚未見報道,本文以本實驗室自建的非轉(zhuǎn)染無致瘤性HCS細胞系為體外研究體系對新福林和貝特舒的凋亡誘導(dǎo)作用及其細胞與分子機理進行研究。為了研究新福林對HCS細胞的毒性影響、凋亡誘導(dǎo)作用及其細胞與分子機理,本文將臨床濃度為100 g/L的新福林經(jīng)倍比稀釋至0.78125 g/L作用于HCS細胞,通過光鏡觀察、細胞活力和細胞周期檢測觀察其對HCS細胞的影響,光鏡觀察結(jié)果顯示濃度高于0.78125 g/L的新福林可導(dǎo)致HCS細胞出現(xiàn)細胞皺縮、胞質(zhì)空泡化、生長增殖異常等變化并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,細胞活力檢測結(jié)果表明濃度高于1.5625 g/L的新福林均可引起HCS細胞的細胞活力下降,細胞周期檢測結(jié)果表明6.25 g/L的新福林引起HCS細胞發(fā)生S期阻滯,這說明了新福林對HCS細胞具有毒性作用。細胞活力下降和細胞周期受阻均與細胞凋亡有密切聯(lián)系,為了檢測新福林對HCS細胞的毒性作用是否引起HCS細胞的凋亡,本文對其質(zhì)膜通透性變化、磷脂酰絲氨酸外翻、DNA斷片化和超微結(jié)構(gòu)進行了檢測,質(zhì)膜通透性檢測結(jié)果顯示濃度高于3.125 g/L的新福林均對質(zhì)膜通透性產(chǎn)生了顯著影響,6.25 g/L的新福林可導(dǎo)致HCS細胞發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻和DNA斷片化,且伴隨胞質(zhì)空炮化、核固縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體等典型凋亡結(jié)構(gòu)特征出現(xiàn),說明了新福林對HCS細胞確實具有凋亡誘導(dǎo)作用。細胞凋亡可以通過幾個途徑起作用且有很多凋亡蛋白的參與,為了進一步研究新福林引起HCS細胞凋亡的細胞與分子機理,本文對6.25 g/L新福林處理的HCS細胞進行了Bcl-2家族蛋白的表達、線粒體膜電位和Caspase-3,8,9活性的檢測。Bcl-2家族蛋白的檢測顯示新福林引起HCS細胞促凋亡蛋白Bad和Bax表達升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達下降,線粒體膜電位發(fā)生去極化,且Caspase-8,9,3活性先后均增大,揭示新福林通過線粒體途徑和死亡受體途徑共同作用調(diào)控HCS細胞的凋亡。為了研究貝特舒對HCS細胞的毒性影響、凋亡誘導(dǎo)作用及其細胞與分子機理,本文將臨床濃度為2.8 g/L的貝特舒經(jīng)倍比稀釋至0.04375 g/L作用于HCS細胞,光鏡觀察結(jié)果顯示濃度高于0.0875g/L的貝特舒可導(dǎo)致HCS細胞出現(xiàn)細胞皺縮、胞質(zhì)空泡化、生長增殖異常等變化并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,細胞活力檢測結(jié)果表明濃度高于0.0875 g/L的貝特舒均可引起HCS細胞的細胞活力下降,細胞周期檢測結(jié)果表明0.7 g/L的貝特舒引起HCS細胞發(fā)生G1期阻滯,這說明了貝特舒對HCS細胞具有毒性作用。進一步研究其凋亡誘導(dǎo)作用,質(zhì)膜通透性檢測結(jié)果顯示濃度高于0.0875 g/L的貝特舒均對質(zhì)膜通透性產(chǎn)生了顯著影響,6.25 g/L的貝特舒可導(dǎo)致HCS細胞發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻和DNA斷片化,且伴隨胞質(zhì)空炮化、核固縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體等典型凋亡結(jié)構(gòu)特征出現(xiàn),說明了貝特舒對HCS細胞確實具有凋亡誘導(dǎo)作用。Bcl-2家族蛋白的檢測顯示貝特舒引起HCS細胞促凋亡蛋白Bad和Bax表達升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達下降,線粒體膜電位發(fā)生去極化,且Caspase-9,3活性先后均增大,揭示貝特舒對HCS細胞的凋亡誘導(dǎo)作用具有線粒體依賴性。綜上所述,在人角膜基質(zhì)細胞系的體系中新福林和貝特舒均具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用,且具有濃度和時間依賴性,新福林是通過線粒體途徑和死亡受體途徑的共同作用實現(xiàn)的,貝特舒是通過線粒體途徑實現(xiàn)的。臨床上應(yīng)謹慎使用新福林和貝特舒,避免長期重復(fù)使用。
【關(guān)鍵詞】：新福林 貝特舒 人角膜基質(zhì)細胞 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻綜述13-27
• 1 青光眼13-14
• 1.1 青光眼和高眼壓13
• 1.2 青光眼和高眼壓的藥物治療13-14
• 1.3 散瞳劑的應(yīng)用14
• 2 擬腎上腺素藥新福林和抗腎上腺素藥貝特舒14-19
• 2.1 擬腎上腺素藥新福林15-18
• 2.1.1 新福林眼部應(yīng)用的作用機理15-16
• 2.1.2 新福林在眼科中的應(yīng)用16-17
• 2.1.3 新福林眼局部應(yīng)用的不良反應(yīng)17-18
• 2.2 抗腎上腺素藥貝特舒18-19
• 2.2.1 貝特舒眼部應(yīng)用的作用機理18-19
• 2.2.2 貝特舒在眼科中的應(yīng)用19
• 2.2.3 貝特舒眼局部應(yīng)用的不良反應(yīng)19
• 3 細胞凋亡概述19-26
• 3.1 細胞凋亡的途徑19-23
• 3.1.1 死亡受體途徑20-21
• 3.1.2 線粒體途徑21-22
• 3.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑22
• 3.1.4 胱冬肽酶非依賴性途徑22-23
• 3.2 細胞凋亡的過程及特征23
• 3.2.1 細胞凋亡的過程及形態(tài)學(xué)特征23
• 3.2.2 細胞凋亡的生化特征23
• 3.3 細胞凋亡的檢測23-26
• 3.3.1 形態(tài)學(xué)觀察24
• 3.3.2 質(zhì)膜通透性檢測24
• 3.3.3 DNA降解分析24-25
• 3.3.4 DNA原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)25
• 3.3.5 細胞凋亡相關(guān)蛋白檢測25-26
• 4 本文的目的及意義26-27
• 第二章 新福林對人角膜基質(zhì)細胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究27-51
• 1 實驗材料與用品27-30
• 1.1 實驗材料27
• 1.2 實驗藥品27-28
• 1.3 實驗儀器28-29
• 1.4 幾種主要溶液的配方29-30
• 2 實驗方法30-36
• 2.1 實驗前的準(zhǔn)備30-31
• 2.1.1 人角膜基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)30
• 2.1.2 人角膜基質(zhì)細胞的收獲、傳代和接板30-31
• 2.1.3 倍比稀釋法得不同濃度新福林31
• 2.2 不同濃度新福林處理HCS細胞的實驗方法31-36
• 2.2.1 用不同濃度新福林處理HCS細胞的形態(tài)學(xué)觀察31-32
• 2.2.2 用不同濃度新福林處理HCS細胞的MTT檢測32
• 2.2.3 新福林處理HCS細胞的細胞周期檢測32-33
• 2.2.4 用不同濃度新福林處理HCS細胞的AO/EB熒光雙染色33
• 2.2.5 新福林處理HCS細胞的磷脂酰絲氨酸的質(zhì)膜定位檢測33-34
• 2.2.6 新福林處理HCS細胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳34
• 2.2.7 新福林處理HCS細胞的透射電鏡檢測34
• 2.2.8 新福林處理HCS細胞的Bcl-2家族蛋白檢測34-35
• 2.2.9 新福林處理HCS細胞的線粒體膜電位檢測35
• 2.2.10 新福林處理HCS細胞的Caspase活性檢測35-36
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析36
• 3 實驗結(jié)果36-46
• 3.1 不同濃度新福林處理HCS細胞的形態(tài)學(xué)變化36-38
• 3.2 不同濃度新福林處理HCS細胞的MTT檢測38-39
• 3.3 新福林處理HCS細胞的細胞周期檢測39-40
• 3.4 新福林處理HCS細胞的磷脂酰絲氨酸的質(zhì)膜定位檢測40-41
• 3.5 新福林處理HCS細胞的DNA斷片化41-42
• 3.6 不同濃度新福林處理HCS細胞的超微結(jié)構(gòu)變化42-43
• 3.7 新福林處理HCS細胞的線粒體膜電位檢測43-44
• 3.8 新福林處理HCS細胞的Bcl-2家族蛋白檢測44-45
• 3.9 新福林處理HCS細胞的線粒體膜電位檢測45-46
• 3.10 新福林處理HCS細胞的Caspase活性檢測46
• 4 討論46-49
• 5 結(jié)論49-51
• 第三章 貝特舒對人角膜基質(zhì)細胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究51-70
• 1 實驗材料與用品51-52
• 1.1 實驗材料51
• 1.2 實驗藥品51
• 1.3 實驗儀器51
• 1.4 幾種主要溶液的配方51-52
• 2 實驗方法52-55
• 2.1 實驗前的準(zhǔn)備52
• 2.1.1 人角膜基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)52
• 2.1.2 人角膜基質(zhì)細胞的收獲、傳代和接板52
• 2.1.3 倍比稀釋法得不同濃度貝特舒52
• 2.2 不同濃度貝特舒處理HCS細胞的實驗方法52-55
• 2.2.1 用不同濃度貝特舒處理HCS細胞的形態(tài)學(xué)觀察52
• 2.2.2 用不同濃度貝特舒處理HCS細胞的MTT檢測52-53
• 2.2.3 貝特舒處理HCS細胞的細胞周期檢測53
• 2.2.4 用不同濃度貝特舒處理HCS細胞的AO/EB熒光雙染色53
• 2.2.5 貝特舒處理HCS細胞的磷脂酰絲氨酸的質(zhì)膜定位檢測53-54
• 2.2.6 貝特舒處理HCS細胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳54
• 2.2.7 貝特舒處理HCS細胞的透射電鏡檢測54
• 2.2.8 貝特舒處理HCS細胞的Bcl-2家族蛋白檢測54
• 2.2.9 貝特舒處理HCS細胞的線粒體膜電位檢測54-55
• 2.2.10 貝特舒處理HCS細胞的Caspase活性檢測55
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析55
• 3 實驗結(jié)果55-66
• 3.1 不同濃度貝特舒處理HCS細胞的形態(tài)學(xué)變化55-58
• 3.2 不同濃度貝特舒處理HCS細胞的MTT檢測58-59
• 3.3 貝特舒處理HCS細胞的細胞周期檢測59-60
• 3.4 不同濃度貝特舒處理HCS細胞的質(zhì)膜通透性變化60-61
• 3.5 貝特舒處理HCS細胞的磷脂酰絲氨酸的質(zhì)膜定位檢測61-62
• 3.6 貝特舒處理HCS細胞的DNA斷片化62-63
• 3.7 不同濃度貝特舒處理HCS細胞的超微結(jié)構(gòu)變化63-64
• 3.8 貝特舒處理HCS細胞的Bcl-2家族蛋白檢測64-65
• 3.9 貝特舒處理HCS細胞的線粒體膜電位檢測65-66
• 3.10 貝特舒處理HCS細胞的Caspase活性檢測66
• 4 討論66-68
• 5 結(jié)論68-70
• 全文總結(jié)70-71
• 參考文獻71-79
• 致謝79-80
• 個人簡歷80-81
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及專利81

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張德才;王寶勇;;前房內(nèi)注射不同濃度腎上腺素液對白內(nèi)障手術(shù)散大瞳孔的研究[J];河北醫(yī)藥;2014年05期

2 郭華;夏國慶;;翼狀胬肉切除術(shù)前應(yīng)用去氧腎上腺素預(yù)防復(fù)發(fā)的效果[J];江蘇醫(yī)藥;2014年03期

3 孫倩;樊廷俊;邱月;葛源;于苗苗;;貝特舒對人角膜上皮細胞凋亡誘導(dǎo)作用的實驗研究[J];山東大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版);2013年07期

4 樊廷俊;胡修忠;葛源;;人類角膜基質(zhì)細胞研究進展[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年08期

5 陳妍遐;韓玉萍;李冰;;圓錐角膜細胞凋亡表達的研究[J];中國醫(yī)學(xué)工程;2012年07期

6 ;Establishment of an untransfected human corneal stromal cell line and its biocompatibility to acellular porcine corneal stroma[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2012年03期

7 趙鳳命;張談順;王仲兵;鄭明學(xué);;鈣離子與細胞凋亡[J];中國動物檢疫;2012年02期

8 武峰;趙秀麗;;治療青光眼藥物的研究進展[J];中華眼科醫(yī)學(xué)雜志(電子版);2011年01期

9 張廣智;胡長敏;陳穎鈺;劉穎;李帥;羅雨;王金勇;郭愛珍;陳煥春;;細胞凋亡的主要檢測方法研究進展[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2011年08期

10 朱秀敏;;細胞凋亡的形態(tài)特征與分子機制研究進展[J];中國老年學(xué)雜志;2011年13期

，

本文編號：1073433