本文關(guān)鍵詞：苯丙氨酸二肽與siRNA共組裝轉(zhuǎn)運(yùn)體的制備及抗腫瘤活性研究

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【摘要】：RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是指雙鏈RNA(ds RNA)能夠高效、特異性地促進(jìn)同源m RNA降解,從而阻斷目標(biāo)基因表達(dá)的現(xiàn)象。這種RNAi機(jī)制在生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在,并且由于其能夠方便、快捷地阻斷目標(biāo)基因的表達(dá),近些年已經(jīng)成為基因治療的有效手段之一。其中,利用RNAi技術(shù)阻斷腫瘤細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的特定信號(hào)通路,可高效、便捷地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,是目前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)課題之一。目前,RNAi技術(shù)臨床應(yīng)用過(guò)程中面臨著的瓶頸主要是si RNA的有效遞送問(wèn)題。優(yōu)秀的si RNA的遞送載體應(yīng)具備以下幾個(gè)要素:(1)易與si RNA結(jié)合,并能保護(hù)si RNA不被核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)降解,同時(shí)載體與si RNA復(fù)合物又不能影響si RNA進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮作用;(2)載體材料轉(zhuǎn)染效率高;(3)對(duì)特異組織或特異細(xì)胞具有靶向性,可以提高特異組織或細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率,從而提高特異組織或細(xì)胞的RNAi效率;(4)材料毒性低,不易引起機(jī)體的免疫反應(yīng),生物相容性好,容易在生物體內(nèi)降解。通過(guò)對(duì)目前已知的si RNA遞送載體比較后我們發(fā)現(xiàn),陽(yáng)離子多肽載體是目前較為理想的載體材料之一。其具有容易合成,尺寸可調(diào)控,結(jié)構(gòu)容易修飾,可修飾靶向配體使其具有靶向定位功能,并且材料性質(zhì)穩(wěn)定,細(xì)胞毒性低,在生物體內(nèi)容易被代謝等優(yōu)點(diǎn)[1]�；诖�,本課題考察了苯丙氨酸二肽納米球(CDPNTs)作為一種新型si RNA載體的應(yīng)用潛力。我們以卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)為細(xì)胞模型,考察了CDPNTs遞送survivin基因的si RNA的能力,以及促SK-OV-3細(xì)胞的凋亡情況。在本論文中,我們主要考察了CDPNTs載體材料的細(xì)胞毒性,與si RNA結(jié)合情況,轉(zhuǎn)染情況,對(duì)survivin基因m RNA干擾效果,以及對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的促凋亡作用。檢測(cè)結(jié)果表明CDPNTs材料細(xì)胞毒性較低,CDPNTs濃度分別為10和100μg/m L時(shí),SK-OV-3細(xì)胞48小時(shí)存活率分別為88.241±1.739%和83.102±5.428%。而陽(yáng)性對(duì)照組Lipofectamine 2000(5μg/m L)的細(xì)胞存活率為80.440±5.842%,由此可見(jiàn)濃度為10-100μg/m L的CDPNTs細(xì)胞毒性均低于Lipofectamine 2000;我們通過(guò)瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)證明,CDPNTs可以與si RNA穩(wěn)定結(jié)合;CDPNTs遞送FAM標(biāo)記的si RNA進(jìn)入細(xì)胞后,熒光顯微鏡觀察到FAM-si RNA集中在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中;CDPNTs遞送si RNA進(jìn)入細(xì)胞后可以正常發(fā)揮RNAi作用,我們用CDPNTs遞送了抑制凋亡的survivin基因的si RNA進(jìn)入SK-OV-3細(xì)胞48小時(shí)后,細(xì)胞中survivin基因m RNA的表達(dá)被顯著抑制,并且細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。
【關(guān)鍵詞】：RNA干擾 siRNA載體 苯丙氨酸二肽自組裝納米球 survivin
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 縮略詞語(yǔ)表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-29
• 1.1 RNAi簡(jiǎn)介12-14
• 1.2 RNAi應(yīng)用于腫瘤的治療14-18
• 1.2.1 腫瘤發(fā)生相關(guān)基因——survivin15-18
• 1.2.1.1 Survivin簡(jiǎn)介15-18
• 1.2.1.2.1 survivin基因的調(diào)控15-16
• 1.2.1.2.2 Survivin對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控16-17
• 1.2.1.2.3 Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控17-18
• 1.3 siRNA的遞送研究進(jìn)展18-24
• 1.3.1 siRNA化學(xué)修飾后直接遞送19
• 1.3.2 siRNA的載體遞送19-24
• 1.3.2.1 siRNA的病毒載體20-21
• 1.3.2.2 siRNA的非病毒載體21-24
• 1.3.2.2.1 siRNA的陽(yáng)離子脂質(zhì)體載體21-22
• 1.3.2.2.2 siRNA的陽(yáng)離子聚合物載體22-23
• 1.3.2.2.3 siRNA的陽(yáng)離子多肽載體23-24
• 1.4 苯丙氨酸二肽24-26
• 1.5 選題目的與設(shè)計(jì)26-29
• 1.5.1 選題目的26-27
• 1.5.2 論文設(shè)計(jì)27-29
• 第二章 材料與方法29-42
• 2.1 材料與試劑29-31
• 2.1.1 材料列表29-30
• 2.1.2 主要試劑列表30-31
• 2.2 主要儀器和設(shè)備列表31-32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法32-42
• 2.3.1 固相肽合成法合成苯丙氨酸二肽32-34
• 2.3.2 苯丙氨酸二肽的自組裝34-35
• 2.3.3 苯丙氨酸二肽自組裝結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察35
• 2.3.4 CDPNTs表面電位檢測(cè)35
• 2.3.5 CDPNTs與siRNA連接的檢測(cè)35
• 2.3.6 SK-OV-3 細(xì)胞系的培養(yǎng)35-36
• 2.3.7 CDPNTs細(xì)胞毒性檢測(cè)36
• 2.3.8 CDPNTs遞送siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)36
• 2.3.9 survivin基因的siRNA的合成36-37
• 2.3.10 CDPNTs遞送FAM-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)37
• 2.3.11 CDPNTs遞送survivin siRNA轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細(xì)胞后survivin mRNA表達(dá)量檢測(cè)37-40
• 2.3.12 CDPNTs遞送survivin siRNA轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細(xì)胞后細(xì)胞凋亡檢測(cè)40-41
• 2.3.13 數(shù)據(jù)分析41-42
• 第三章 結(jié)果與討論42-57
• 3.1 苯丙氨酸二肽合成與純化42-43
• 3.2 苯丙氨酸二肽自組裝掃描電鏡觀察43-44
• 3.3 CDPNTs表面電位檢測(cè)44-45
• 3.4 CDPNTs與siRNA連接的檢測(cè)45-46
• 3.5 CDPNTs細(xì)胞毒性檢測(cè)46-47
• 3.6 CDPNTs遞送siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)47-48
• 3.7 CDPNTs遞送survivin siRNA轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細(xì)胞后survivin mRNA表達(dá)量檢測(cè)48-51
• 3.7.1 survivin基因RT-PCR檢測(cè)48-49
• 3.7.2 survivin基因REAL-TIME PCR檢測(cè)49-51
• 3.8 CDPNTs遞送survivin siRNA轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細(xì)胞后細(xì)胞凋亡檢測(cè)51-55
• 3.8.1 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察51-52
• 3.8.2 CDPNTs遞送survivin siRNA轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細(xì)胞后細(xì)胞存活率檢測(cè)52-53
• 3.8.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡53-55
• 3.9 討論55-57
• 第四章 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-69
• 致謝69

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