本文關(guān)鍵詞：莪術(shù)烯與腫瘤靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機(jī)制研究

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【摘要】：根據(jù)科學(xué)家們在全球范圍對肺癌進(jìn)行的調(diào)查顯示,這些年肺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升的趨勢,而這個趨勢在我國特別突出。據(jù)統(tǒng)計,每一年我國有超65萬同胞因為肺癌而死。目前,肺癌的臨床醫(yī)治方案針對不同的類型有所差別,小細(xì)胞肺癌(SCLC)對放療和化療敏感,而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)則以手術(shù)為主。在化療方面,傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類抗癌藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時,也對肝腎和造血系統(tǒng)等器官產(chǎn)生不可逆的毒性和損傷作用,產(chǎn)生極為嚴(yán)重的毒副作用。為了解決這一現(xiàn)狀,本課題在前期確認(rèn)莪術(shù)醇具有抗肺癌藥效學(xué)作用的工作基礎(chǔ)上,擬進(jìn)一步對莪術(shù)中另一個含量較高的化合物莪術(shù)烯的抗腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行研究。同時,設(shè)計合成具有肺癌靶向性的ZT-21,然后對它的抗肺癌活性及機(jī)制進(jìn)行研究。目標(biāo)在于闡明莪術(shù)烯的成藥性,同時確認(rèn)ZT-21是否具有高效低毒的抗肺癌效應(yīng)。本論文主要分為兩章:第一章:圍繞中藥單體化合物莪術(shù)烯的抗肺癌藥效學(xué)展開研究,闡明其抗腫瘤效應(yīng),如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則對其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究;第二章:根據(jù)課題組前期的分子影像學(xué)研究確認(rèn)的精氨酸在肺癌組織中靶向性分布聚集效應(yīng)顯著的結(jié)果,擬以精氨酸為靶向載體,通過與草酰氯單乙酯耦聯(lián)合成獲得三羧酸關(guān)鍵代謝質(zhì)草酰乙酸的類似物ZT-21,以獲得靶向性抗腫瘤代謝從而產(chǎn)生抗肺癌效應(yīng),對其體內(nèi)外抗肺癌藥效學(xué)、藥物最大耐受量等成藥性指標(biāo)進(jìn)行了評價。第一章本章圍繞中藥單體莪術(shù)烯的抗肺癌藥效學(xué)及其機(jī)制進(jìn)行研究,以初步明確莪術(shù)烯是否為先導(dǎo)抗癌化合物。本章共分為六節(jié)。第一節(jié)采用MTT法研究了莪術(shù)烯對正常成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞及非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖的影響。實驗結(jié)果顯示:不同濃度的莪術(shù)烯(6.25,12.5,25,50,100μM·L-1)處理SPC-A1細(xì)胞后,其生長狀況都受到莪術(shù)烯不同程度的抑制影響,其抑制作用呈時間依賴性和濃度依賴性,通過SPSS V.11統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,莪術(shù)烯處理SPC-A1細(xì)胞24小時,48小時,72小時后的IC50值分別為403.8μM·L-1、154.8μm·l-1、47.01μm·l-1。而莪術(shù)烯對mrc-5細(xì)胞的生長無顯著抑制作用。本結(jié)果提示,莪術(shù)烯對非小細(xì)胞肺癌spc-a1細(xì)胞具有選擇性抑制作用,同時也表明莪術(shù)烯具有較高的安全性。第二節(jié)采用hoechst33258染色法觀察不同濃度的莪術(shù)烯(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)處理后spc-a1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。實驗結(jié)果顯示:在熒光倒置顯微鏡下觀察,與空白對照組相比,不同劑量的莪術(shù)烯分別處理spc-a1細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變,存活的細(xì)胞減少,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核收縮,一些細(xì)胞核破碎成塊,且著色較深,并呈現(xiàn)較亮的藍(lán)色,并且隨著莪術(shù)烯給藥劑量的增加,spc-a1細(xì)胞數(shù)量減少,凋亡小體比例增加。本實驗結(jié)果提示,在一定劑量范圍內(nèi)莪術(shù)烯對spc-a1細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用。第三節(jié)采用流式細(xì)胞術(shù)通過fitc-annexinv/pi雙標(biāo)記染色法檢測莪術(shù)烯對spc-a1細(xì)胞凋亡率的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),莪術(shù)烯作用于spc-a1細(xì)胞48h后,凋亡細(xì)胞均明顯多于空白對照組,并且凋亡細(xì)胞數(shù)目隨莪術(shù)烯的濃度增高而增加,呈現(xiàn)濃度依賴性,不同濃度的莪術(shù)烯(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)總凋亡率分別為7.00%、17.43%、38.52%、58.21%、72.85%,該結(jié)果與mtt實驗結(jié)果基本一致,提示大劑量莪術(shù)烯可以明顯殺傷spc-a1細(xì)胞,小劑量莪術(shù)烯可以誘導(dǎo)spc-a1細(xì)胞凋亡。第四節(jié)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測莪術(shù)烯對細(xì)胞周期的影響。實驗結(jié)果顯示,對照組峰形為典型腫瘤細(xì)胞的峰形,與對照組相比,隨著莪術(shù)烯濃度的升高,細(xì)胞g2/m期比例增大,表現(xiàn)出一定的濃度依賴性,但s期、g0/g1期并沒有呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。提示莪術(shù)烯是將spc-a1細(xì)胞阻滯在g2/m期,以抑制細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行,進(jìn)而達(dá)到抑制spc-a1細(xì)胞增殖的目的。第五節(jié)采用real-timepcr和westernblot檢測莪術(shù)烯對spc-a1細(xì)胞gsta1表達(dá)的影響。實驗結(jié)果顯示:莪術(shù)烯處理后spc-a1細(xì)胞的gsta1基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào),且莪術(shù)烯濃度越高,gsta1基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量越低。第六節(jié)建立裸鼠皮下移植瘤模型,以腫瘤的重量抑制率為藥效學(xué)評價指標(biāo),檢測莪術(shù)烯對荷瘤裸鼠腫瘤生長的抑制作用。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成5組(模型組、陽性對照組(β-欖香烯組,135mg·kg-1·d-1)、莪術(shù)烯高劑量組(135mg·kg-1·d-1)、中劑量組(45mg·kg-1·d-1)、低劑量組(15mg·kg-1·d-1)),6只每組,雌雄各一半,采用腹腔注射給藥方式,連續(xù)給藥12天。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):在給藥期間,各實驗組動物均未出現(xiàn)死亡,體重變化曲線和模型組相比較沒有出現(xiàn)顯著性差異,各實驗組動物臟器系數(shù)除莪術(shù)烯中低劑量的肝組織以及陽性組的腎組織與模型組相比有些差異外,其余組別臟器與模型組相比沒有出現(xiàn)明顯的差異。以瘤重為指標(biāo)計算腫瘤抑制率,結(jié)果顯示莪術(shù)烯高、中、低三個劑量組的腫瘤抑制率分別為66.03%、28.34%、3.49%,陽性對照組β-欖香烯組的抑瘤率為49.57%。結(jié)果表明,莪術(shù)烯抑瘤效果與莪術(shù)烯的劑量呈劑量依賴性,顯示出一定的抑瘤效果。第二章本章以腫瘤細(xì)胞特異性吸收的精氨酸為靶向載體,通過與草酰氯單乙酯耦聯(lián)合成獲得內(nèi)源性物質(zhì)草酰乙酸的類似物zt-21,并對其成藥性以及機(jī)制進(jìn)行研究,本章分為四節(jié)。第一節(jié)zt-21化合物的合成。利用液相合成的方法將精氨酸與草酰氯單乙酯耦聯(lián),利用hplc、ms、1h-nmr、13c-nmr等檢測手段對zt-21的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,表征結(jié)果顯示所得化合物的m/z為246,與zt-21的相對分子量相符;利用萃取的方法對zt-21進(jìn)行純化,最終得到純度為96.56%的白色或類白色蓬松狀固體zt-21。第二節(jié)zt-21化合物的初步穩(wěn)定性研究。主要是對zt-21化合物穩(wěn)定性的影響因素試驗、加速試驗、長期試驗進(jìn)行研究。影響因素試驗:zt-21在高溫度(60℃)、高濕度(90%±5%rh,25℃)、強光照射(4500lx±500lx,25℃)環(huán)境下放置10天,分別于第0、5、10天取出,觀察藥品性狀,并按照含量測定標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明,zt-21在高濕環(huán)境下出現(xiàn)吸潮凝結(jié)現(xiàn)象,但含量測定結(jié)果顯示含量穩(wěn)定,而高溫和強光環(huán)境下吸潮現(xiàn)象不明顯,且含量測定結(jié)果顯示含量穩(wěn)定。加速試驗:zt-21在加速環(huán)境(40℃±2℃,75%±5%rh)放置6個月,在試驗期內(nèi)分別于第0、1、2、3、6個月末各取樣一次,按照含量測定標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明,zt-21在加速環(huán)境下放置了6個月后含量穩(wěn)定。長期試驗:zt-21在常溫環(huán)境(25℃±2℃,60%±10%rh)下放置12個月,在試驗期內(nèi)分別于第0、1、3、6、12個月末各取樣一次,按照含量測定標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明,zt-21在常溫下放置了12個月后含量穩(wěn)定。第三節(jié)zt-21化合物的體內(nèi)外藥效學(xué)研究。體外采用mtt法研究了莪術(shù)烯對mrc-5細(xì)胞及spc-a1細(xì)胞增殖的影響。實驗結(jié)果顯示:不同濃度的zt-21(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)處理spc-a1、mrc-5細(xì)胞后,細(xì)胞的生長均未受到明顯抑制。體內(nèi)建立裸鼠皮下移植瘤模型,以腫瘤的質(zhì)量抑制率為藥效學(xué)指標(biāo),給14天藥,檢測ZT-21化合物對腫瘤生長的影響。實驗結(jié)果顯示:ZT-21高劑量(口服)、高劑量(注射)、中劑量(口服)、中劑量(注射)劑量組的抑瘤率分別為60.38%**、52.85%**、39.30%*、29.22%,陽性對照藥順鉑組腫瘤抑制率為66.95%**,表明ZT-21高劑量(口服)組具有與陽性對照藥順鉑組接近的抗腫瘤作用。給藥期間裸鼠的體重變化結(jié)果提示,與模型組相比,從第9天開始,順鉑組動物表現(xiàn)出顯著性差異的體重減輕情況,提示順鉑的嚴(yán)重毒副作用,而ZT-21各給藥組與模型組相比均無顯著性差異,提示ZT-21的安全性良好。第四節(jié)ZT-21化合物的抗肺癌作用機(jī)制研究。采用Real-time PCR檢測ZT-21化合物對荷瘤裸鼠腫瘤組織氨基酸轉(zhuǎn)運體LAT1 mRNA表達(dá)的影響。采用Western blot檢測ZT-21化合物對荷瘤裸鼠腫瘤組織氨基酸轉(zhuǎn)運體LAT1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。實驗結(jié)果顯示:LAT1氨基酸轉(zhuǎn)運體在ZT-21不同給藥組對荷SPC-A1細(xì)胞瘤裸鼠腫瘤組織中LAT1表達(dá)水平與對照組相比均有一定差異性,通過與藥效學(xué)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)給藥后腫瘤組織中LAT1轉(zhuǎn)運體的表達(dá)量與給藥劑量成正相關(guān),即給藥劑量越大LAT1轉(zhuǎn)運體mRN表達(dá)量A和蛋白表達(dá)量越高,腫瘤抑制率越高。綜上所述,莪術(shù)烯能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞SPC-A1的生長,并具有一定的時間依賴性和濃度依賴性,但莪術(shù)烯對人胚胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5的生長不具有抑制作用,提示了莪術(shù)烯對肺癌細(xì)胞抑制作用具有一定的選擇性。體外試驗推測莪術(shù)烯主要通過將SPC-A1阻滯在G2/M期抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂,并下調(diào)GSTA1的表達(dá),從而抑制SPC-A1細(xì)胞增殖。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)烯對荷瘤裸鼠皮下移植瘤具有一定的抑制效果,抑瘤率與藥物濃度成正相關(guān)。另外本研究自主合成的新化合物ZT-21具有一定的抗肺癌活性,而且毒副作用大大低于陽性對照藥順鉑,其抗腫瘤機(jī)制可能與上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運體LAT1的表達(dá)有關(guān)。本論文對莪術(shù)烯與腫瘤靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機(jī)制研究,為開發(fā)高效低毒、靶點明確及作用機(jī)制明確的抗肺癌藥物提供了一定的參考依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：莪術(shù)烯 ZT-21 靶向性 肺癌 藥效學(xué)
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 英文縮略語13-14
• 前言14-19
• 第一章 莪術(shù)烯的抗肺癌作用及機(jī)制研究19-58
• 第一節(jié) MTT法檢測莪術(shù)烯對肺癌細(xì)胞增殖的影響21-29
• 1 材料21-22
• 2 方法22-25
• 3 結(jié)果25-28
• 4 討論28-29
• 第二節(jié) Hoechst 33258染色檢測莪術(shù)烯對肺癌細(xì)胞SPC-A1形態(tài)學(xué)的影響29-33
• 1 材料29-30
• 2 方法30-31
• 3 結(jié)果31-32
• 4 討論32-33
• 第三節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)FITC-AnnexinV/PI雙標(biāo)記染色法檢測莪術(shù)烯對肺癌細(xì)胞SPC-A1凋亡的影響33-37
• 1 材料33-34
• 2 方法34-35
• 3 結(jié)果35-36
• 4 討論36-37
• 第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)檢測莪術(shù)烯對肺癌SPC-A1細(xì)胞周期的影響37-41
• 1 材料37-38
• 2 方法38-39
• 3 結(jié)果39-40
• 4 討論40-41
• 第五節(jié) 莪術(shù)烯處理對SPC-A1細(xì)胞GSTA1表達(dá)的影響41-51
• 1 材料41-42
• 2 方法42-48
• 3 結(jié)果48-49
• 4 討論49-51
• 第六節(jié) 莪術(shù)烯在SPC-A1細(xì)胞荷瘤裸鼠體內(nèi)藥效學(xué)研究51-58
• 1 材料51-52
• 2 方法52-53
• 3 結(jié)果53-57
• 4 討論57-58
• 第二章 新型靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機(jī)制研究58-91
• 第一節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的設(shè)計與合成60-67
• 1 材料60-61
• 2 方法61-63
• 3 結(jié)果63-66
• 4 討論66-67
• 第二節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的初步穩(wěn)定性研究67-73
• 1 材料67-68
• 2 方法68-69
• 3 結(jié)果69-72
• 4 討論72-73
• 第三節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的體內(nèi)外藥效學(xué)研究73-81
• 1 材料73-74
• 2 方法74-76
• 3 結(jié)果76-80
• 4 討論80-81
• 第四節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用機(jī)制研究81-91
• 1 材料81-82
• 2 方法82-88
• 3 結(jié)果88-89
• 4 討論89-91
• 結(jié)論與創(chuàng)新性91-92
• 參考文獻(xiàn)92-97
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的主要論文97-98
• 致謝98

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王有娣;莪術(shù)烯與腫瘤靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機(jī)制研究[D];廣東藥科大學(xué);2016年

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本文編號：1017293