本文關鍵詞：莪術烯與腫瘤靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機制研究

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【摘要】：根據科學家們在全球范圍對肺癌進行的調查顯示,這些年肺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升的趨勢,而這個趨勢在我國特別突出。據統(tǒng)計,每一年我國有超65萬同胞因為肺癌而死。目前,肺癌的臨床醫(yī)治方案針對不同的類型有所差別,小細胞肺癌(SCLC)對放療和化療敏感,而非小細胞肺癌(NSCLC)則以手術為主。在化療方面,傳統(tǒng)的細胞毒類抗癌藥物在殺傷腫瘤細胞的同時,也對肝腎和造血系統(tǒng)等器官產生不可逆的毒性和損傷作用,產生極為嚴重的毒副作用。為了解決這一現(xiàn)狀,本課題在前期確認莪術醇具有抗肺癌藥效學作用的工作基礎上,擬進一步對莪術中另一個含量較高的化合物莪術烯的抗腫瘤作用及其機制進行研究。同時,設計合成具有肺癌靶向性的ZT-21,然后對它的抗肺癌活性及機制進行研究。目標在于闡明莪術烯的成藥性,同時確認ZT-21是否具有高效低毒的抗肺癌效應。本論文主要分為兩章:第一章:圍繞中藥單體化合物莪術烯的抗肺癌藥效學展開研究,闡明其抗腫瘤效應,如出現(xiàn)陽性反應則對其抗腫瘤作用機制進行研究;第二章:根據課題組前期的分子影像學研究確認的精氨酸在肺癌組織中靶向性分布聚集效應顯著的結果,擬以精氨酸為靶向載體,通過與草酰氯單乙酯耦聯(lián)合成獲得三羧酸關鍵代謝質草酰乙酸的類似物ZT-21,以獲得靶向性抗腫瘤代謝從而產生抗肺癌效應,對其體內外抗肺癌藥效學、藥物最大耐受量等成藥性指標進行了評價。第一章本章圍繞中藥單體莪術烯的抗肺癌藥效學及其機制進行研究,以初步明確莪術烯是否為先導抗癌化合物。本章共分為六節(jié)。第一節(jié)采用MTT法研究了莪術烯對正常成纖維細胞MRC-5細胞及非小細胞肺癌SPC-A1細胞增殖的影響。實驗結果顯示:不同濃度的莪術烯(6.25,12.5,25,50,100μM·L-1)處理SPC-A1細胞后,其生長狀況都受到莪術烯不同程度的抑制影響,其抑制作用呈時間依賴性和濃度依賴性,通過SPSS V.11統(tǒng)計分析,結果表明,莪術烯處理SPC-A1細胞24小時,48小時,72小時后的IC50值分別為403.8μM·L-1、154.8μm·l-1、47.01μm·l-1。而莪術烯對mrc-5細胞的生長無顯著抑制作用。本結果提示,莪術烯對非小細胞肺癌spc-a1細胞具有選擇性抑制作用,同時也表明莪術烯具有較高的安全性。第二節(jié)采用hoechst33258染色法觀察不同濃度的莪術烯(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)處理后spc-a1細胞的形態(tài)學變化。實驗結果顯示:在熒光倒置顯微鏡下觀察,與空白對照組相比,不同劑量的莪術烯分別處理spc-a1細胞后,腫瘤細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)學改變,存活的細胞減少,凋亡細胞的細胞核收縮,一些細胞核破碎成塊,且著色較深,并呈現(xiàn)較亮的藍色,并且隨著莪術烯給藥劑量的增加,spc-a1細胞數(shù)量減少,凋亡小體比例增加。本實驗結果提示,在一定劑量范圍內莪術烯對spc-a1細胞具有誘導凋亡作用。第三節(jié)采用流式細胞術通過fitc-annexinv/pi雙標記染色法檢測莪術烯對spc-a1細胞凋亡率的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn),莪術烯作用于spc-a1細胞48h后,凋亡細胞均明顯多于空白對照組,并且凋亡細胞數(shù)目隨莪術烯的濃度增高而增加,呈現(xiàn)濃度依賴性,不同濃度的莪術烯(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)總凋亡率分別為7.00%、17.43%、38.52%、58.21%、72.85%,該結果與mtt實驗結果基本一致,提示大劑量莪術烯可以明顯殺傷spc-a1細胞,小劑量莪術烯可以誘導spc-a1細胞凋亡。第四節(jié)采用流式細胞術檢測莪術烯對細胞周期的影響。實驗結果顯示,對照組峰形為典型腫瘤細胞的峰形,與對照組相比,隨著莪術烯濃度的升高,細胞g2/m期比例增大,表現(xiàn)出一定的濃度依賴性,但s期、g0/g1期并沒有呈現(xiàn)一定的劑量關系。提示莪術烯是將spc-a1細胞阻滯在g2/m期,以抑制細胞有絲分裂的進行,進而達到抑制spc-a1細胞增殖的目的。第五節(jié)采用real-timepcr和westernblot檢測莪術烯對spc-a1細胞gsta1表達的影響。實驗結果顯示:莪術烯處理后spc-a1細胞的gsta1基因和蛋白質表達量下調,且莪術烯濃度越高,gsta1基因和蛋白質表達量越低。第六節(jié)建立裸鼠皮下移植瘤模型,以腫瘤的重量抑制率為藥效學評價指標,檢測莪術烯對荷瘤裸鼠腫瘤生長的抑制作用。將荷瘤裸鼠隨機分成5組(模型組、陽性對照組(β-欖香烯組,135mg·kg-1·d-1)、莪術烯高劑量組(135mg·kg-1·d-1)、中劑量組(45mg·kg-1·d-1)、低劑量組(15mg·kg-1·d-1)),6只每組,雌雄各一半,采用腹腔注射給藥方式,連續(xù)給藥12天。實驗結果發(fā)現(xiàn):在給藥期間,各實驗組動物均未出現(xiàn)死亡,體重變化曲線和模型組相比較沒有出現(xiàn)顯著性差異,各實驗組動物臟器系數(shù)除莪術烯中低劑量的肝組織以及陽性組的腎組織與模型組相比有些差異外,其余組別臟器與模型組相比沒有出現(xiàn)明顯的差異。以瘤重為指標計算腫瘤抑制率,結果顯示莪術烯高、中、低三個劑量組的腫瘤抑制率分別為66.03%、28.34%、3.49%,陽性對照組β-欖香烯組的抑瘤率為49.57%。結果表明,莪術烯抑瘤效果與莪術烯的劑量呈劑量依賴性,顯示出一定的抑瘤效果。第二章本章以腫瘤細胞特異性吸收的精氨酸為靶向載體,通過與草酰氯單乙酯耦聯(lián)合成獲得內源性物質草酰乙酸的類似物zt-21,并對其成藥性以及機制進行研究,本章分為四節(jié)。第一節(jié)zt-21化合物的合成。利用液相合成的方法將精氨酸與草酰氯單乙酯耦聯(lián),利用hplc、ms、1h-nmr、13c-nmr等檢測手段對zt-21的結構進行表征,表征結果顯示所得化合物的m/z為246,與zt-21的相對分子量相符;利用萃取的方法對zt-21進行純化,最終得到純度為96.56%的白色或類白色蓬松狀固體zt-21。第二節(jié)zt-21化合物的初步穩(wěn)定性研究。主要是對zt-21化合物穩(wěn)定性的影響因素試驗、加速試驗、長期試驗進行研究。影響因素試驗:zt-21在高溫度(60℃)、高濕度(90%±5%rh,25℃)、強光照射(4500lx±500lx,25℃)環(huán)境下放置10天,分別于第0、5、10天取出,觀察藥品性狀,并按照含量測定標準方法進行測定。結果表明,zt-21在高濕環(huán)境下出現(xiàn)吸潮凝結現(xiàn)象,但含量測定結果顯示含量穩(wěn)定,而高溫和強光環(huán)境下吸潮現(xiàn)象不明顯,且含量測定結果顯示含量穩(wěn)定。加速試驗:zt-21在加速環(huán)境(40℃±2℃,75%±5%rh)放置6個月,在試驗期內分別于第0、1、2、3、6個月末各取樣一次,按照含量測定標準方法進行測定。結果表明,zt-21在加速環(huán)境下放置了6個月后含量穩(wěn)定。長期試驗:zt-21在常溫環(huán)境(25℃±2℃,60%±10%rh)下放置12個月,在試驗期內分別于第0、1、3、6、12個月末各取樣一次,按照含量測定標準方法進行測定。結果表明,zt-21在常溫下放置了12個月后含量穩(wěn)定。第三節(jié)zt-21化合物的體內外藥效學研究。體外采用mtt法研究了莪術烯對mrc-5細胞及spc-a1細胞增殖的影響。實驗結果顯示:不同濃度的zt-21(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)處理spc-a1、mrc-5細胞后,細胞的生長均未受到明顯抑制。體內建立裸鼠皮下移植瘤模型,以腫瘤的質量抑制率為藥效學指標,給14天藥,檢測ZT-21化合物對腫瘤生長的影響。實驗結果顯示:ZT-21高劑量(口服)、高劑量(注射)、中劑量(口服)、中劑量(注射)劑量組的抑瘤率分別為60.38%**、52.85%**、39.30%*、29.22%,陽性對照藥順鉑組腫瘤抑制率為66.95%**,表明ZT-21高劑量(口服)組具有與陽性對照藥順鉑組接近的抗腫瘤作用。給藥期間裸鼠的體重變化結果提示,與模型組相比,從第9天開始,順鉑組動物表現(xiàn)出顯著性差異的體重減輕情況,提示順鉑的嚴重毒副作用,而ZT-21各給藥組與模型組相比均無顯著性差異,提示ZT-21的安全性良好。第四節(jié)ZT-21化合物的抗肺癌作用機制研究。采用Real-time PCR檢測ZT-21化合物對荷瘤裸鼠腫瘤組織氨基酸轉運體LAT1 mRNA表達的影響。采用Western blot檢測ZT-21化合物對荷瘤裸鼠腫瘤組織氨基酸轉運體LAT1蛋白質表達的影響。實驗結果顯示:LAT1氨基酸轉運體在ZT-21不同給藥組對荷SPC-A1細胞瘤裸鼠腫瘤組織中LAT1表達水平與對照組相比均有一定差異性,通過與藥效學結果比較發(fā)現(xiàn)給藥后腫瘤組織中LAT1轉運體的表達量與給藥劑量成正相關,即給藥劑量越大LAT1轉運體mRN表達量A和蛋白表達量越高,腫瘤抑制率越高。綜上所述,莪術烯能抑制非小細胞肺癌細胞SPC-A1的生長,并具有一定的時間依賴性和濃度依賴性,但莪術烯對人胚胎肺成纖維細胞MRC-5的生長不具有抑制作用,提示了莪術烯對肺癌細胞抑制作用具有一定的選擇性。體外試驗推測莪術烯主要通過將SPC-A1阻滯在G2/M期抑制腫瘤細胞有絲分裂,并下調GSTA1的表達,從而抑制SPC-A1細胞增殖。體內研究發(fā)現(xiàn)莪術烯對荷瘤裸鼠皮下移植瘤具有一定的抑制效果,抑瘤率與藥物濃度成正相關。另外本研究自主合成的新化合物ZT-21具有一定的抗肺癌活性,而且毒副作用大大低于陽性對照藥順鉑,其抗腫瘤機制可能與上調氨基酸轉運體LAT1的表達有關。本論文對莪術烯與腫瘤靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機制研究,為開發(fā)高效低毒、靶點明確及作用機制明確的抗肺癌藥物提供了一定的參考依據。
【關鍵詞】：莪術烯 ZT-21 靶向性 肺癌 藥效學
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 英文縮略語13-14
• 前言14-19
• 第一章 莪術烯的抗肺癌作用及機制研究19-58
• 第一節(jié) MTT法檢測莪術烯對肺癌細胞增殖的影響21-29
• 1 材料21-22
• 2 方法22-25
• 3 結果25-28
• 4 討論28-29
• 第二節(jié) Hoechst 33258染色檢測莪術烯對肺癌細胞SPC-A1形態(tài)學的影響29-33
• 1 材料29-30
• 2 方法30-31
• 3 結果31-32
• 4 討論32-33
• 第三節(jié) 流式細胞術FITC-AnnexinV/PI雙標記染色法檢測莪術烯對肺癌細胞SPC-A1凋亡的影響33-37
• 1 材料33-34
• 2 方法34-35
• 3 結果35-36
• 4 討論36-37
• 第四節(jié) 流式細胞術檢測莪術烯對肺癌SPC-A1細胞周期的影響37-41
• 1 材料37-38
• 2 方法38-39
• 3 結果39-40
• 4 討論40-41
• 第五節(jié) 莪術烯處理對SPC-A1細胞GSTA1表達的影響41-51
• 1 材料41-42
• 2 方法42-48
• 3 結果48-49
• 4 討論49-51
• 第六節(jié) 莪術烯在SPC-A1細胞荷瘤裸鼠體內藥效學研究51-58
• 1 材料51-52
• 2 方法52-53
• 3 結果53-57
• 4 討論57-58
• 第二章 新型靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機制研究58-91
• 第一節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的設計與合成60-67
• 1 材料60-61
• 2 方法61-63
• 3 結果63-66
• 4 討論66-67
• 第二節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的初步穩(wěn)定性研究67-73
• 1 材料67-68
• 2 方法68-69
• 3 結果69-72
• 4 討論72-73
• 第三節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的體內外藥效學研究73-81
• 1 材料73-74
• 2 方法74-76
• 3 結果76-80
• 4 討論80-81
• 第四節(jié) 新型靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用機制研究81-91
• 1 材料81-82
• 2 方法82-88
• 3 結果88-89
• 4 討論89-91
• 結論與創(chuàng)新性91-92
• 參考文獻92-97
• 攻讀學位期間發(fā)表的主要論文97-98
• 致謝98

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1 王有娣;莪術烯與腫瘤靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用與機制研究[D];廣東藥科大學;2016年

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本文編號：1017293