納米級超聲造影劑制備及其初步應(yīng)用

發(fā)布時間：2017-10-11 11:44

本文關(guān)鍵詞：納米級超聲造影劑制備及其初步應(yīng)用

【摘要】：目的通過控制脂質(zhì)體薄膜的厚度,在不需要制備納米級和微米級混合超聲造影劑(Ultrasound contrast agents,UCA)或者添加表面活性劑的條件下,直接制作出粒徑均一純的脂質(zhì)納米級超聲造影劑簡稱納米氣泡,進一步分別檢測:1、其粒徑、電位、穩(wěn)定性等理化特性。2、離心對納米氣泡的影響。3、納米氣泡的細胞毒性。最后,通過與已商品化的微米級氣泡造影劑——聲諾維進行體、內(nèi)外成像效果對比,評價納米氣泡增強顯影的效果及優(yōu)勢。方法納米氣泡制作方法為薄膜水化法。將7mg,14mg,21mg,28mg固定比例的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和二硬脂�；字Ｒ掖及�-聚乙二醇(DSPE-PEG(2000))分別加入4個25ml旋蒸瓶。再分別向4個旋蒸瓶內(nèi)各加入2ml氯仿,震蕩旋蒸瓶使脂質(zhì)體充分溶解。在此步驟,可加入少量紅色熒光染料Di I,為后續(xù)納米氣泡熒光檢測準備。若加入在熒光染料Di I,后續(xù)步驟需進行避光處理,以防止熒光染料淬滅。在55℃,120rpm/min條件下,各旋蒸瓶在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min,各瓶內(nèi)形成薄膜,隨著脂質(zhì)體用量增加,薄膜厚度增加。四個旋蒸瓶分別加入0.5ml,1ml,1.5ml,2ml水合液(10%甘油與90%PBS(V/V))后,將旋蒸瓶置于恒溫搖床內(nèi),在37℃,130rpm/min條件下震蕩1小時,形成脂質(zhì)體懸液。取少量懸液做掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)檢測。每個旋蒸瓶內(nèi)取0.5ml懸液置于密閉小管內(nèi),抽空小管內(nèi)的氣體,并注入八氟丙烷(C3F8)。將小管放入銀汞調(diào)和器中震蕩45秒后,形成的乳白色液體。加入PBS將每個小管內(nèi)的乳白色液體稀釋至8ml。每組樣本各取2ml,動態(tài)光散射儀(Dynamic Light Scattering,DLS)檢測其粒徑及電位,并取2ml聲諾維作為對照組。根據(jù)DLS結(jié)果,取少量納泡(14mg DPPC和DSPEPEG(2000)制備)及聲諾維進行SEM檢測及熒光顯微鏡觀測。將納米去泡置于25℃條件下,分別于1min,15min,30min,45min和60min后檢測其粒徑及濃度,評估納米氣泡的穩(wěn)定性。根據(jù)DLS結(jié)果,取納米級與微米級混合造影劑(21mg DPPC和DSPEPEG(2000)制備),分別在20g,50g和805g條件下離心5分鐘,檢測其粒徑。利用MTT法檢測脂質(zhì)體的細胞毒性。在體外觀測納米氣泡與聲諾維的增強成像效果,利用軟件Image J采集灰階值,進行統(tǒng)計學(xué)分析。建立荷瘤裸鼠模型,經(jīng)尾靜脈注入納米氣泡及聲諾維,記錄增強顯影圖像,并利用軟件進行灰階值采集,進行統(tǒng)計學(xué)分析。取荷瘤裸鼠的腫瘤和肌肉,制作病理切片,熒光標記血管、細胞核,利用激光掃描共聚焦(confocal laser scan microscopy,CLSM)觀測帶熒光的納米氣泡和聲諾維組織位置。結(jié)果4組樣本的粒徑分別為565.2±201.5nm(n=3),457.9±113.8nm(n=3),960.8±59.5nm(n=3),1121.1±57.0nm(n=3),聲諾維的粒徑為1614.8±224.7nm(n=3)。納米氣泡(14mg DPPC和DSPE-PEG(2000)制備)的電位結(jié)果為-21.48±7.46 m V(n=3),而聲諾維的電位結(jié)果為-32.29±13.13 m V(n=3)。統(tǒng)計學(xué)分析后顯示,兩者沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.283)。SEM觀測下,納泡與聲諾維的形態(tài)相似,均為單一類圓形空洞,大小與DLS結(jié)果基本相同,脂質(zhì)體為類圓形小球。穩(wěn)定性結(jié)果顯示,在25℃條件下,納米氣泡在制作后1min,15min,30min,45min和60min粒徑分別為457.9±113.8 nm(n=3),504.3±74.1 nm(n=3),519.5±95.5 nm(n=3),625.9±100.6 nm(n=3)和709.5±272.0 nm(n=3),濃度分別為10.01×106±1.75×106/ml(n=5),9.31×106±1.22×106/ml(n=5),8.22×106±1.17×106/ml(n=5),7.96×106±1.09×106/ml(n=5)和6.07×106±1.20×106/ml(n=5)。統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),60min后產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異。對納米級與微米級混合造影劑(14mg DPPC和DSPE-PEG(2000)制備)進行離心后發(fā)現(xiàn),歷經(jīng)均有增大,20 g結(jié)果為828.4±425.7 nm(n=3),50 g離心結(jié)果為882.1±417.6 nm(n=3),805 g離心結(jié)果為977.2±65.9 nm(n=3)。MTT法檢測脂質(zhì)體細胞毒性結(jié)果顯示:當脂質(zhì)體濃度增加到10μg/ml時出現(xiàn)明顯毒性,而納米氣泡體內(nèi)成像時的脂質(zhì)體濃度小于5μg/ml。體外成像結(jié)果經(jīng)Image J采集灰階值后,納米氣泡為58.482±28.192d B(n=5),聲諾維為52.861±11.491 d B(n=5)。T檢驗分析,兩者并無統(tǒng)計學(xué)差異。荷瘤小鼠體內(nèi)成像結(jié)果顯示,經(jīng)尾靜脈注射后,納泡與聲諾維均有增強顯影。聲諾維和納米氣泡均在注射后30秒達到峰值。納泡成像持續(xù)時間長于聲諾維。兩者在2min時產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異,納米氣泡成像強于聲諾維。病理切片CLSM結(jié)果顯示納米氣泡組腫瘤組織血管外細胞間有紅色熒光,而肌肉組織切片內(nèi)無紅色熒光;聲諾維組僅在腫瘤組織血管中見少量紅色熒光,而細胞間未見紅色熒光。結(jié)論利用25ml旋蒸瓶,14mg DPPC和DSPE-PEG(2000),通過薄膜水化法可以制作出厚度合適的脂質(zhì)體薄膜,在不需要制備納米級和微米級混合超聲造影劑或者添加表面活性劑的條件下,直接制作出純的粒徑均一的納米級超聲造影劑。SEM和熒光顯微鏡觀測結(jié)果與DLS相近。納米氣泡展現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,并且沒有明顯的細胞毒性。納泡在體外可以達到與聲諾維相同的成像效果,而體內(nèi)成像持續(xù)時間比聲諾維更長。病理CLSM結(jié)果顯示納泡可以透過血管進入腫瘤組織細胞間隙。
【關(guān)鍵詞】：納米氣泡 脂質(zhì)體 分子影像 超聲造影劑 腫瘤成像
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：