本文關(guān)鍵詞：鼻咽癌HOX基因表達(dá)譜及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 鼻咽癌 HOX基因 Pol Ⅱ stalling TETs 5hmC DNA去甲基化 能量代謝

【摘要】：同源異型基因HOX基因(Homeotic genes)屬于同源異形盒(Homeobox)家族一員,是一類進(jìn)化高度保守的轉(zhuǎn)錄因子。HOX基因通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控發(fā)育相關(guān)基因,控制組織和器官的形成。目前研究表明HOX基因表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常,某些重大疾病如惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展也與HOX基因表達(dá)譜異常密切相關(guān)。 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是一種在世界上大部分地區(qū)罕見(jiàn)但在中國(guó)南部以及東南亞地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤,其主要的致病因素EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)編碼的潛伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein1, LMP1)是目前已被確證具有瘤基因功能的蛋白。我們以鼻咽癌細(xì)胞為模型,通過(guò)基因芯片和RT-PCR方法在細(xì)胞水平檢測(cè)了HOX基因表達(dá)譜,LMP1陽(yáng)性鼻咽癌細(xì)胞系與陰性細(xì)胞系相比,部分HOX基因如HOXA5, HOXB3, HOXB13, HOXC8等比陰性細(xì)胞系異常低表達(dá)。隨后,我們又在23例鼻咽癌組織樣本中通過(guò)免疫組化方法在組織水平發(fā)現(xiàn)LMP1陽(yáng)性組織中這些HOX基因同樣發(fā)生低表達(dá)趨勢(shì),與細(xì)胞水平結(jié)果一致。我們進(jìn)一步采用報(bào)告基因分析法,證明了EBV LMP1可顯著抑制HOXB13和HOXC8啟動(dòng)子活性,并呈劑量依賴效應(yīng)。這些研究發(fā)現(xiàn)提示HOX基因可能為一類受EBVLMP1負(fù)性調(diào)節(jié)的靶基因。 HOX基因表達(dá)調(diào)控涉及多方面,轉(zhuǎn)錄調(diào)控是最為直接有效的方式之一。真核生物基因通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymerase Ⅱ, Pol Ⅱ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA。新近研究表明,在人類基因組中50%的基因處于轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài),20%的基因處于沉默狀態(tài)(無(wú)Pol Ⅱ結(jié)合),其余的基因同樣處于沉默狀態(tài),但近端啟動(dòng)子區(qū)域卻有結(jié)合Pol Ⅱ即處于Pol Ⅱ Stalling狀態(tài)。采用ChIP法,我們通過(guò)檢測(cè)了HOXA5, HOXB3, HOXB13和HOXC8等基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcriptionstart site, TSS)區(qū)域Pol II富集程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMP1陽(yáng)性鼻咽癌細(xì)胞系中HOX基因的TSS區(qū)域同樣有Pol Ⅱ的富集,表明這些HOX基因?yàn)镾talled基因,提示EBV LMP1可通過(guò)Pol II Stalling的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式調(diào)控HOX基因。 放射治療為目前鼻咽癌的主要治療方式。放射處理可誘發(fā)DNA損傷修復(fù)(DNA Damage Response, DDR),令人感興趣的是,DDR可誘發(fā)一些靶基因發(fā)生DNA去甲基化。新近報(bào)道,5hmC直接參與DNA去甲基化過(guò)程,而DNA去甲基化與基因重新活化相關(guān)。我們首先通過(guò)放射處理CNE1-LMP1細(xì)胞建立DNA損傷修復(fù)模型,在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)放射處理可使LMP1失活的HOXA5,HOXB3, HOXB13和HOXC8等基因重新活化,其機(jī)制與這些HOX基因TSS區(qū)的Stalled Pol Ⅱ重新釋放和5mC及5hmC甲基化水平降低等有關(guān),并伴隨DNA去甲基化酶TET2表達(dá)水平增高。這些研究提示TET2和5hmC有可能參與DNA去甲基化,從而釋放Stalled Pol Ⅱ,導(dǎo)致HOX基因的重新活化。 我們通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在60種腫瘤細(xì)胞系(http://discover.nci.nih.gov/cellminer/analysis.do)中HOXA5,HOXB3, HOXB13, HOXC8與多種能量代謝基因具有顯著相關(guān)性,這提示我們HOX基因可能作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)腫瘤能量代謝具有重要作用,其中HOXC8與能量代謝相關(guān)基因最為密切。因此,我們以HOXC8為例研究其在鼻咽癌中的生物學(xué)功能。我們將外源性HOXC8導(dǎo)入LMP1陽(yáng)性鼻咽癌細(xì)胞系CNE1-LMP1,通過(guò)MTS方法發(fā)現(xiàn)HOXC8可顯著抑制其增值,通過(guò)臨床生化儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)乳酸形成和葡萄糖消耗均顯著降低,并發(fā)現(xiàn)HOXC8可顯著抑制HK2和GLUT1等糖酵解關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平,上調(diào)TIGAR糖酵解負(fù)性調(diào)控因子表達(dá),表明HOXC8可能具有抑制糖酵解的作用。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)HOXC8可以促進(jìn)氧化磷酸化重要酶類SC02的表達(dá),提示與之密切相關(guān)的三羧酸循環(huán)可能得到增強(qiáng)。因此,我們進(jìn)一步檢測(cè)了三羧酸循環(huán)中的一些重要酶類,例如2-羥基戊二酸脫氫酶(2-hydroxyglutaric acid dehydrogenase,2-HGDH)、琥珀酸脫氫酶復(fù)合物Ⅱ D(succinate dehydrogenase D, SDHD)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutaratedehydrogenase, a-KGDH)包括OGDH, DLST、DLD三種亞基、延胡索酸(fumarate hydratase, FH)以及順烏頭酸酶(aconitase)包括ACO1和AC02等,發(fā)現(xiàn)HOXC8均能顯著上調(diào)這些酶類的表達(dá),并且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。這些研究進(jìn)一步表明HOXC8可能直接靶向三羧酸循環(huán)中的重要酶類。 本課題以鼻咽癌為模型,研究了HOX基因表達(dá)譜與鼻咽癌之間的內(nèi)在聯(lián)系,發(fā)現(xiàn)HOX基因在EBV-LMP1陽(yáng)性鼻咽癌中發(fā)生Pol Ⅱ Stalling,表達(dá)受到顯著抑制。放射處理可誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù),其機(jī)制可能通過(guò)TET2和5hmC介導(dǎo)DNA去甲基化,影響Stalled Pol Ⅱ釋放和HOX基因的重新活化。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 HOX基因 Pol Ⅱ stalling TETs 5hmC DNA去甲基化 能量代謝
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 英文縮寫注解14-16
• 第一章 鼻咽癌中HOX基因表達(dá)譜16-39
• 1.1 前言16-23
• 1.2 材料與方法23-31
• 1.2.1 材料23-25
• 1.2.1.1 細(xì)胞系23
• 1.2.1.2 質(zhì)粒23-24
• 1.2.1.3 主要試劑和試劑盒24-25
• 1.2.1.4 主要儀器25
• 1.2.2 主要方法25-31
• 1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 1.2.2.2 細(xì)胞總RNA的抽提和濃度測(cè)定26
• 1.2.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR26-27
• 1.2.2.4 Real-Time PCR27
• 1.2.2.5 感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化27
• 1.2.2.6 細(xì)菌培養(yǎng)及質(zhì)粒抽提27-28
• 1.2.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因28
• 1.2.2.8 免疫組化28-29
• 1.2.2.9 染色質(zhì)免疫沉淀29-31
• 1.3 結(jié)果31-38
• 1.3.1 鼻咽癌細(xì)胞系中HOX基因的表達(dá)情況31-34
• 1.3.2 鼻咽癌組織中的HOX基因表達(dá)情況34-35
• 1.3.3 EBV LMP1抑制HOX基因啟動(dòng)子活性35-37
• 1.3.4 鼻咽癌中HOX基因受到PolⅡstalling調(diào)控37-38
• 小結(jié)38-39
• 第二章 放療所致DNA損傷誘導(dǎo)HOX基因活化機(jī)制研究39-53
• 2.1 前言39-42
• 2.2 材料與方法42-46
• 2.2.1 材料42-43
• 2.2.1.1 細(xì)胞系42
• 2.2.1.2 主要試劑和試劑盒42
• 2.2.1.3 主要儀器42-43
• 2.2.2 主要方法43-46
• 2.2.2.1 激光共聚焦熒光顯微鏡(LCFM)檢測(cè)43
• 2.2.2.2 彗星實(shí)驗(yàn)43-44
• 2.2.2.3 染色質(zhì)免疫沉淀44
• 2.2.2.4 甲基化DNA免疫沉淀MeDIP44
• 2.2.2.5 PvuRts1I酶切鑒定5hmC變化44-46
• 2.3 結(jié)果46-52
• 2.3.1 放射處理誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷修復(fù)DDR46-48
• 2.3.2 DDR可誘使HOX基因重新活化48-49
• 2.3.3 放射處理促進(jìn)Stalled HOX基因發(fā)生PolⅡ釋放49-50
• 2.3.4 放射處理后HOX基因近端啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生DNA去甲基化50-52
• 小結(jié)52-53
• 第三章 HOX基因?qū)Ρ茄拾┠芰看x的調(diào)節(jié)53-68
• 3.1 前言53-58
• 3.2 材料與方法58-62
• 3.2.1 材料58-59
• 3.2.1.1 細(xì)胞系58
• 3.2.1.2 質(zhì)粒58-59
• 3.2.1.3 主要試劑和試劑盒59
• 3.2.1.4 主要儀器59
• 3.2.2 主要方法59-62
• 3.2.2.1 感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化59
• 3.2.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及質(zhì)粒抽提59
• 3.2.2.3 細(xì)胞總RNA的抽提和濃度測(cè)定59
• 3.2.2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR59-60
• 3.2.2.5 Real-Time PCR60-61
• 3.2.2.6 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線61
• 3.2.2.7 葡萄糖消耗及乳酸形成測(cè)定61-62
• 3.3 結(jié)果62-67
• 3.3.1 HOXC8可抑制CNE1-LMP1細(xì)胞的增殖62-63
• 3.3.2 HOXC8對(duì)細(xì)胞能量代謝的影響63-67
• 小結(jié)67-68
• 分析與討論68-72
• 總結(jié)論72-73
• 參考文獻(xiàn)73-81
• 綜述81-115
• Genome-wide distribution of DNA methylation and DNA demethylation and related chromatin regulators in cancer81-108
• References93-106
• 附圖106-108
• DNA甲基化、SNP與腫瘤108-115
• 參考文獻(xiàn)112-115
• 攻讀學(xué)位期間的主要研究成果115-116
• 致謝116-117

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王承興,鄧錫云,李曉艷,顧煥華,易薇,翁新憲,夏林慶,曹亞;EB病毒LMP1及其CTAR1、CTAR2導(dǎo)入人HNE2鼻咽癌細(xì)胞的研究[J];病毒學(xué)報(bào);2001年04期

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本文編號(hào)：582117