本文關(guān)鍵詞：攜線粒體DNA A1555G突變的聾病患者特異性iPS細(xì)胞系的建立與鑒定

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【摘要】：聾病是全球性公共衛(wèi)生問題。目前全球有3.6億聾病患者,其中我國(guó)有約3000多萬聾病患者。耳聾是由遺傳和環(huán)境因素引起的,其中50%的耳聾患者是由遺傳因素造成的,線粒體基因編碼的12S rRNAA15555G突變是氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征耳聾的重要原因。由于線粒體的多拷貝性和雙重膜結(jié)構(gòu),目前尚缺乏有效的技術(shù)手段對(duì)線粒體基因進(jìn)行定點(diǎn)突變或改造或構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型,嚴(yán)重制約線粒體基因突變相關(guān)的疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究。 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells, iPS cells or iPSCs)是一類通過在體細(xì)胞中人為表達(dá)特定轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程而獲得的類似胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞類型�；颊咛禺愋詉PS細(xì)胞則是將患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞。其原代細(xì)胞來源于患者本身,克服了動(dòng)物模型存在的物種差異性；原代細(xì)胞來源廣泛,克服了取材上的困難；更重要的是還保持患者基因組尤其是致病基因不變,為各種疾病的研究提供一個(gè)良好的細(xì)胞模型。 本論文通過收集攜線粒體DNA A1555G突變的聾病患者及與其相同線粒體基因組單體型的正常人尿液中的腎小管上皮脫落細(xì)胞,經(jīng)離體培養(yǎng)擴(kuò)增,建立攜mtDNAA1555G突變的聾病患者尿液細(xì)胞系正常人尿液細(xì)胞系。然后利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct-4, Sox-2, c-Myc, Klf4)導(dǎo)入尿液細(xì)胞,建立聾病特異性iPS細(xì)胞系和正常人iPS細(xì)胞系。光學(xué)顯微鏡觀察,iPS細(xì)胞聚集形成類似ES細(xì)胞緊湊的多細(xì)胞集落,呈現(xiàn)克隆邊緣明顯,核質(zhì)比高的特點(diǎn)。通過堿性磷酸酶染色(AP染色)、熒光定量PCR、甲基化分析、免疫熒光實(shí)驗(yàn)、插入鑒定、核型分析等方法鑒定,顯示上述細(xì)胞具有較高的堿性磷酸酶活性；內(nèi)源多能性基因的表達(dá)量顯著高于原代尿液細(xì)胞,外源多能性基因沉默；Nanog和Oct-4基因啟動(dòng)子區(qū)為去甲基化狀態(tài),尿液細(xì)胞為高甲基化狀態(tài)；細(xì)胞表達(dá)ES細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物,包括SSEA3、SSEA4,腫瘤相關(guān)抗原TRA-1-60、TRA-1-81,以及核蛋白NANOG;四個(gè)外源性轉(zhuǎn)錄因子基因已經(jīng)整合到iPS細(xì)胞的染色體基因組中；細(xì)胞核型正常,為46條染色體、XY型。體外擬胚體誘導(dǎo)和體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)表明上述iPS細(xì)胞具有分化為三胚層組織細(xì)胞的潛能。同時(shí),對(duì)誘導(dǎo)出的iPS細(xì)胞系進(jìn)行全序列線粒體DNA的PCR測(cè)序,顯示患者iPS細(xì)胞仍然保留A1555G突變并且和原代尿液細(xì)胞相比未出現(xiàn)新的突變。 綜上所述,本論文成功建立了攜線粒體DNAA1555G突變的聾病特異性iPS細(xì)胞系。為深入闡明聾病的致病機(jī)制及藥物篩選提供可靠的細(xì)胞模型,為聾病的診斷和治療開拓了新思路。
【關(guān)鍵詞】：聾病 線粒體DNA A1555G突變 患者特異性iPS細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R764.43
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文縮略詞10-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-31
• 1 引言15
• 2 線粒體疾病15-16
• 3 線粒體聾病16-20
• 3.1 聾病的致病因素16-17
• 3.2 與非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體12S rRNA基因突變17-18
• 3.3 氨基糖苷類藥物性耳聾與線粒體12S rRNA基因A1555G突變18-19
• 3.4 線粒體單體型對(duì)mtDNA突變致聾的影響19-20
• 4 患者特異性iPS細(xì)胞模型20-30
• 4.1 iPS細(xì)胞20-21
• 4.2 患者特異性iPS細(xì)胞21-26
• 4.3 患者特異性iPS細(xì)胞作為疾病模型的優(yōu)勢(shì)26-27
• 4.4 患者特異性iPS細(xì)胞在線粒體疾病研究中的應(yīng)用27-30
• 5 總結(jié)30-31
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究31-84
• 1 引言31-32
• 2 實(shí)驗(yàn)材料32-38
• 2.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞32
• 2.2 質(zhì)粒32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑及配置32-37
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)液配置32-35
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制35-36
• 2.3.3 實(shí)驗(yàn)試劑36-37
• 2.4 試劑盒37
• 2.5 實(shí)驗(yàn)儀器37-38
• 3 實(shí)驗(yàn)方法38-63
• 3.1 尿液細(xì)胞的收集和分離38-39
• 3.1.1 尿液樣本的采集38
• 3.1.2 尿液細(xì)胞的分離38-39
• 3.1.3 尿液細(xì)胞的傳代39
• 3.1.4 尿液細(xì)胞的凍存39
• 3.2 CF-1孕鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備39-42
• 3.2.1 CF-1孕鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離39-40
• 3.2.2 細(xì)胞的凍存40-41
• 3.2.3 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備41-42
• 3.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝和感染42-44
• 3.3.1 pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和抽提42
• 3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝42-43
• 3.3.3 病毒的收集和感染43
• 3.3.4 感染后細(xì)胞的接種43-44
• 3.4 iPS細(xì)胞克隆的挑取、維護(hù)與培養(yǎng)44-47
• 3.4.1 iPS單克隆的挑取44
• 3.4.2 iPS細(xì)胞的有飼養(yǎng)層培養(yǎng)44-46
• 3.4.2.1 iPS細(xì)胞的傳代44-45
• 3.4.2.2 iPS細(xì)胞的維護(hù)45
• 3.4.2.3 iPS細(xì)胞的凍存45
• 3.4.2.4 iPS細(xì)胞的復(fù)蘇45-46
• 3.4.3 iPS細(xì)胞的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)46-47
• 3.4.3.1 iPS細(xì)胞的傳代46
• 3.4.3.2 iPS細(xì)胞的維護(hù)46-47
• 3.4.3.3 iPS細(xì)胞的凍存47
• 3.4.3.4 iPS細(xì)胞的復(fù)蘇47
• 3.5 iPS細(xì)胞的生物學(xué)鑒定47-63
• 3.5.1 堿性磷酸酶檢測(cè)(AP染色)47-48
• 3.5.2 免疫熒光檢測(cè)48-49
• 3.5.3 內(nèi)源多能性基因和外源編程基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)49-52
• 3.5.3.1 細(xì)胞收集49
• 3.5.3.2 RNA提取49-50
• 3.5.3.3 反轉(zhuǎn)錄50
• 3.5.3.4 熒光定量PCR檢測(cè)50-52
• 3.5.4 外源編程基因的插入鑒定52-53
• 3.5.4.1 DNA提取52
• 3.5.4.2 PCR反應(yīng)52-53
• 3.5.4.3 1%瓊脂糖凝膠電泳53
• 3.5.5 iPS細(xì)胞的核型分析53-54
• 3.5.6 多能性基因(Oct4、Nanog)啟動(dòng)子的甲基化水平檢測(cè)54-59
• 3.5.6.1 DNA提取54
• 3.5.6.2 DNA樣品處理54
• 3.5.6.3 啟動(dòng)子區(qū)域的PCR擴(kuò)增54-56
• 3.5.6.4 PCR產(chǎn)物的膠回收56-57
• 3.5.6.5 T載體的連接與轉(zhuǎn)化57-58
• 3.5.6.6 挑菌與菌落PCR58
• 3.5.6.7 數(shù)據(jù)處理58-59
• 3.5.7 體外分化擬胚體59-60
• 3.5.7.1 擬胚體的培養(yǎng)59
• 3.5.7.2 多能性基因的表達(dá)檢測(cè)59-60
• 3.5.8 體內(nèi)分化畸胎瘤60-61
• 3.5.9 線粒體DNA A1555G突變的鑒定61-62
• 3.5.9.1 DNA提取(TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit)61-62
• 3.5.10 線粒體結(jié)構(gòu)的透射電子顯微鏡觀察62-63
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析63-80
• 4.1 臨床資料63-65
• 4.2 尿液細(xì)胞的收集、分離及培養(yǎng)65-66
• 4.3 CF-1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備66-67
• 4.4 病毒的包裝、收集和滴度測(cè)定67
• 4.5 尿液細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染67-68
• 4.6 iPS克隆的形成68-69
• 4.7 iPS細(xì)胞的培養(yǎng)69-70
• 4.8 堿性磷酸酶染色(AP染色)70
• 4.9 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與分析70-71
• 4.10 內(nèi)源多能性基因的表達(dá)與分析71-72
• 4.11 外源編程基因沉默的表達(dá)與分析72-73
• 4.12 外源編程基因的插入鑒定73
• 4.13 多能性基因(Oct-4,Nanog)啟動(dòng)子的甲基化水平檢測(cè)73-74
• 4.14 核型分析74-75
• 4.15 體外分化擬胚體75-76
• 4.16 擬胚體中三胚層標(biāo)記基因的表達(dá)76-77
• 4.17 體內(nèi)分化畸胎瘤77-78
• 4.18 畸胎瘤組織的切片觀察78-79
• 4.19 線粒體DNA A1555G突變的分析79
• 4.20 線粒體結(jié)果的透射電子顯微鏡觀察79-80
• 5 討論80-84
• 5.1 建立mtDNA A1555G突變導(dǎo)致的耳聾患者特異性iPS細(xì)胞系的意義80-81
• 5.2 利用尿液細(xì)胞作為原代細(xì)胞進(jìn)行重編程的優(yōu)勢(shì)81-82
• 5.3 患者特異性iPS細(xì)胞作為疾病模型面臨的挑戰(zhàn)82-84
• 參考文獻(xiàn)84-100
• 作者簡(jiǎn)歷100

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張忻,康東洋,戴樸,袁慧軍,韓東一,楊偉炎;氨基糖甙類抗生素致聾家系線粒體DNA A1555G突變分析[J];中國(guó)聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志;2004年06期

2 曹新,邢光前,魏欽俊,卜行寬,王登元;線粒體DNA A1555G和961 insC雙重突變導(dǎo)致的非綜合征型遺傳性耳聾[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2004年06期

3 徐延軍;曹菊陽;白琳娜;張昕;申衛(wèi)東;冀飛;翟所強(qiáng);袁慧軍;;線粒體DNA A1555G和G7444A雙重突變導(dǎo)致的非綜合征型遺傳性耳聾[J];中華耳科學(xué)雜志;2005年04期

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本文編號(hào)：545813