本文關(guān)鍵詞：電刺激促進大鼠視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化的初步實驗研究

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【摘要】：青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離等疾病可以造成視網(wǎng)膜神經(jīng)元不同程度的凋亡,最終導(dǎo)致不可逆性視力損害。目前臨床上尚無根治這類疾病的有效方法,神經(jīng)保護藥物或神經(jīng)營養(yǎng)因子補充等方法只是著眼于保護未凋亡的神經(jīng)元,對于已經(jīng)受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)元卻無能為力；干細胞的應(yīng)用則是立足于施救已受損的神經(jīng)元,可在一定程度上逆轉(zhuǎn)疾病的進程,但干細胞移植治療仍需面臨移植細胞的免疫排斥、供體來源以及與宿主視網(wǎng)膜的有效整合等諸多問題。因此,如何原位誘導(dǎo)自體內(nèi)源性視網(wǎng)膜前體細胞增殖、分化備受研究者的關(guān)注。目前的研究證明,睫狀體邊緣帶細胞、虹膜色素上皮細胞、Muller細胞都可能作為成年哺乳動物的視網(wǎng)膜干細胞來源,其中以睫狀體邊緣帶細胞、Muller細胞來源的視網(wǎng)膜干細胞最為重要,常常被稱為視網(wǎng)膜前體細胞。 電刺激(electrical stimulation, ES)在一些動物模型和臨床研究中都初步顯示了良好的促細胞增殖分化效果,且副作用小,引起了眼科學(xué)者們的關(guān)注。本研究旨在探討電刺激對睫狀體邊緣帶細胞、Muller細胞來源的視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化的影響,并對電刺激后即早基因Gadd45β在視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化過程中的表達調(diào)控作用進行研究和探索。 第一部分 跨角膜電刺激促進成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化 目的旨在探討跨角膜電刺激促進成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化。方法成年雌性SD大鼠予以每日腹腔注射BrdU (100mg/kg),連續(xù)腹腔注射5天用于標(biāo)記增殖細胞。大鼠左眼接受電刺激(電刺激參數(shù)：雙相方波電流：波寬3ms,頻率20Hz,強度300uA,刺激時間持續(xù)1h),右眼為自身對照,并設(shè)假手術(shù)組,每組每時點為4只SD大鼠。電刺激后不同時間點(1d、4d、7d、10d、14d)心臟灌注處死SD大鼠后摘除眼球制作視網(wǎng)膜冰凍切片,免疫熒光觀察睫狀體邊緣帶BrdU (?)日性細胞以明確增殖細胞的數(shù)量及部位并計數(shù),免疫化學(xué)染色共聚焦顯微鏡觀察睫狀體邊緣帶BrdU陽性細胞Nestin的表達情況,以明確增殖細胞是否為視網(wǎng)膜前體細胞。為了評估電刺激條件的安全性,選取電極作用部位的角膜組織,電鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。同時,在大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)檢測到即早基因Gadd45β的表達并進一步Western Blot免疫印跡法檢測電刺激后大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gadd45β的表達水平。 結(jié)果電刺激前后大鼠角膜組織形態(tài)未發(fā)生明顯改變,提示該電刺激條件具有一定的安全性。視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光觀察顯示：電刺激后第4天SD大鼠睫狀體邊緣帶細胞開始出現(xiàn)BrdU (?)日性細胞,且電刺激后7d、10d和14d睫狀體邊緣帶BrdU陽性細胞數(shù)明顯增多,BrdU (?)日性細胞計數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。電刺激后第4天SD大鼠睫狀體邊緣帶BrdU細胞Nestin染色陽性,且隨時間的延長Nestin染色陽性逐漸增強,提示電刺激后大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞存在增殖現(xiàn)象。電刺激后大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gadd45β的表達一過性增加。 結(jié)論經(jīng)角膜低電流刺激后成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象,并伴有視網(wǎng)膜內(nèi)即早基因Gadd45β一過性表達增加。 第二部分 電刺激促進大鼠視網(wǎng)膜Muller細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子作用的評估 目的旨在探討電刺激影響大鼠視網(wǎng)膜Muller細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子。 方法選取新生2天SD大鼠視網(wǎng)膜Muller細胞體外培養(yǎng),電鏡下觀察體外培養(yǎng)的Muller細胞的形態(tài)；谷氨酰胺合成酶(GS)免疫細胞化學(xué)染色鑒定體外培養(yǎng)的Muller細胞表型。參考國內(nèi)外相關(guān)文獻給予Muller細胞一定模式的電刺激(電刺激參數(shù)：雙相方波電流,電刺激參數(shù)：波寬3ms,頻率20Hz,強度300uA,單次刺激時間1h),電刺激后不同時間點(Oh、1n、2h、3h、6h、12h)行Realtime-PCR、Western Blot檢測BDNF、bFGF神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌情況及Gadd45家族各因子的表達情況。 結(jié)果電鏡下觀察體外培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜Muller細胞呈細長形似纖維,免疫細胞化學(xué)染色顯示Muller細胞特異性谷氨酰胺合成酶(+),電刺激后1-12h內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、FGF的表達水平持續(xù)明顯增加,電刺激后1-3h內(nèi)視網(wǎng)膜Muller細胞內(nèi)Gadd45β的表達一過性增加,符合即早基因表達的時間特點。 結(jié)論低電流電刺激能促進視網(wǎng)膜Muller細胞內(nèi)Gadd45β一過性的表達增加,可能通過調(diào)控BDNF/FGF基因的DNA去甲基化,增加BDNF/FGF的分泌。多頻次電刺激有望持續(xù)增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌。
【關(guān)鍵詞】：電刺激 視網(wǎng)膜前體細胞 增殖 分化 神經(jīng)營養(yǎng)因子 Gadd45β
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 中英文縮寫一覽表3-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 經(jīng)角膜低電流刺激促進成年大鼠視網(wǎng)膜睫狀體邊緣帶細胞增殖分化作用的實驗研究12-23
• 材料與方法12-18
• 實驗結(jié)果18-22
• 討論22-23
• 第二部分 低電流刺激促進大鼠視網(wǎng)膜Muller細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子作用的評估23-33
• 材料與方法23-29
• 實驗結(jié)果29-31
• 討論31-33
• 實驗總結(jié)33-34
• 參考文獻34-37
• 附錄37-46
• 綜述37-45
• 參考文獻42-45
• 在讀期間參與發(fā)表論文45-46
• 致謝46-47

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