本文關(guān)鍵詞：醛糖還原酶在視神經(jīng)損傷后的表達(dá)和作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：許多眼科疾病均是在視神經(jīng)損傷后發(fā)生了以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal GanglionCell，RGC）不可逆性凋亡或壞死為主的變化，進(jìn)而導(dǎo)致視神經(jīng)傳導(dǎo)通路的中斷。作為中樞神經(jīng)的代表，視神經(jīng)的損傷和再生機(jī)制近年來(lái)得到深入而廣泛的研究。視神經(jīng)在損傷后或者在周圍神經(jīng)病變中不能再生是目前臨床上亟待解決的問(wèn)題之一。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突形成視神經(jīng)后能夠?qū)⑺幸曈X信息傳遞給神經(jīng)中樞，但是在視神經(jīng)損傷后，由于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不可逆性死亡造成視神經(jīng)不能再生，進(jìn)而導(dǎo)致視力永久性喪失。醛糖還原酶（Aldose Reductase，AR）屬于還原型輔酶II（Nicotinamide Adenosine Dinucleotide Phosphate-Hependent，NADPH)依賴型醛酮還原酶家族[1]。醛糖還原酶是葡萄糖代謝多元醇通路中的重要限速酶[2]。近來(lái)有學(xué)者隨著對(duì)于AR功能研究的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在高血糖狀態(tài)下還是在血糖正常的情況下，AR在介導(dǎo)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及化學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用[3]。本課題研究對(duì)象為AR，重點(diǎn)研究AR在視神經(jīng)損傷后隨時(shí)間的變化情況；AR對(duì)視神經(jīng)損傷后存活和再生的作用及影響，探討視神經(jīng)損傷后AR的表達(dá)情況及AR對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和再生的影響。本研究由以下兩部分實(shí)驗(yàn)組成： 實(shí)驗(yàn)的第一部分是研究AR在小鼠視神經(jīng)損傷后的表達(dá)變化情況。該部分實(shí)驗(yàn)主要是應(yīng)用C57BL/6-AR~(+/+)（野生型）小鼠，建立小鼠視神經(jīng)橫斷（Optic NerveTransaction，ONT)模型[4]，野生型小鼠分組后分別進(jìn)行視神經(jīng)橫斷損傷的手術(shù)及僅分離暴露視神經(jīng)眶內(nèi)段的假手術(shù)處理，分別選取小鼠視神經(jīng)橫斷組及假手術(shù)組術(shù)后0d、3d、5d、7d、14d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取材收集視神經(jīng)橫斷組及假手術(shù)組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜組織提取物，分別應(yīng)用Western Blot、QPCR等方法檢測(cè)AR，觀察視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜AR表達(dá)量的變化情況。 實(shí)驗(yàn)的第二部分是研究AR對(duì)小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的作用及AR對(duì)小鼠視神經(jīng)橫斷損傷后再生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。首先用AR~(-/-)小鼠與YFP小鼠交配，鑒定獲得AR~(-/-)-Thy1-YFP（AR~(-/-)YFP）小鼠。同實(shí)驗(yàn)一的方法，建立Thy1-YFP/AR~(+/+)（AR~(+/+)YFP小鼠）小鼠和Thy1-YFP/AR~(-/-)小鼠（AR~(-/-)YFP小鼠）視神經(jīng)橫斷損傷的模型，分別選取視神經(jīng)橫斷損傷術(shù)后3d、7d、14d等三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取材收集兩組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的眼球組織，應(yīng)用視網(wǎng)膜冰凍切片技術(shù)，熒光顯微鏡下分別觀察計(jì)數(shù)兩組術(shù)后3d、7d、14d存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。其次，同樣建立C57BL/6-AR~(+/+)（野生型）小鼠和C57BL/6-AR~(-/-)（AR基因敲除）小鼠視神經(jīng)橫斷模型，分別選取兩組視神經(jīng)損傷術(shù)后3d、7d、14d等三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取材收集對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的眼球組織進(jìn)行石蠟切片及蘇木精-伊紅染色（HE染色），分別觀察兩組存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞情況。最后利用野生型小鼠和AR基因敲除建立小鼠視神經(jīng)橫斷模型，分別選取兩組視神經(jīng)損傷術(shù)后0d、3d、5d、7d、14d等五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取材收集對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜組織，利用Western Blot的方法分別檢測(cè)兩組神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白（Growth-associated protein-43，GAP-43）的表達(dá)變化情況。 通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)第一部分實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)小鼠視神經(jīng)橫斷組及假手術(shù)組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜AR表達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示：假手術(shù)組AR的表達(dá)量并未隨著損傷時(shí)間的增加而發(fā)生明顯的變化，而視神經(jīng)橫斷組的AR表達(dá)量隨著損傷時(shí)間逐漸升高，并在損傷后第7d達(dá)到高峰，并且QPCR結(jié)果與其結(jié)果趨勢(shì)一致。實(shí)驗(yàn)第二部分中，AR~(+/+)YFP小鼠和AR~(-/-)YFP小鼠視神經(jīng)橫斷損傷手術(shù)后，通過(guò)視網(wǎng)膜冰凍切片，熒光顯微鏡下分別觀察計(jì)數(shù)兩組術(shù)后對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。AR~(-/-)和野生型小鼠視神經(jīng)橫斷損傷手術(shù)后，通過(guò)HE染色分別觀察計(jì)數(shù)兩組術(shù)后對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果顯示：隨著損傷時(shí)間的增加，兩組存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目都逐漸的減少，在損傷后3天，野生型小鼠組和AR敲除小鼠的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化；但從損傷后的第7天開始，AR敲除小鼠組存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯多于野生型小鼠組。AR~(-/-)和野生型小鼠視神經(jīng)橫斷損傷手術(shù)后，通過(guò)Western Blot方法分別檢測(cè)術(shù)后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞存活情況及視網(wǎng)膜GAP-43表達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示：隨著損傷時(shí)間的增加，， GAP-43的表達(dá)量逐漸升高，術(shù)后第7d達(dá)到高峰，并且AR基因敲除小鼠組與野生型小鼠組在損傷后的同一時(shí)間點(diǎn)，對(duì)比觀察到從損傷后第7d開始AR基因敲除小鼠組的GAP-43表達(dá)量明顯高于野生型小鼠組。 通過(guò)上述研究我們發(fā)現(xiàn)：野生型小鼠視神經(jīng)橫斷損傷后隨著損傷時(shí)間AR表達(dá)量逐漸升高，說(shuō)明AR參與了視神經(jīng)損傷后的反應(yīng)過(guò)程；AR~(-/-)YFP小鼠存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目在術(shù)后同一時(shí)間點(diǎn)明顯多于AR~(+/+)YFP小鼠，提示AR可能參與調(diào)節(jié)促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活過(guò)程；AR~(-/-)小鼠視神經(jīng)橫斷損傷后GAP-43表達(dá)量在術(shù)后第7d升高并且從術(shù)后第7d開始AR~(-/-)小鼠組GAP-43表達(dá)量明顯高于野生型小鼠，說(shuō)明AR可能參與影響了視神經(jīng)損傷后再生的調(diào)節(jié)過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：醛糖還原酶 視神經(jīng)橫斷損傷 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R774.6
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-27
• 第一部分 視神經(jīng)損傷后 AR 的表達(dá)變化27-38
• 引言27-28
• 1 材料28-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28
• 1.2 主要試劑28
• 1.3 主要儀器28
• 1.4 主要抗體28
• 1.5 主要引物28-29
• 2 方法29-33
• 2.1 小鼠視神經(jīng)橫斷損傷模型的制備29
• 2.2 免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)29-31
• 2.3 QPCR 檢測(cè)視神經(jīng)橫斷損傷后 AR 的表達(dá)變化31-33
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)33
• 3 結(jié)果33-37
• 3.1 AR 蛋白水平的變化情況33-35
• 3.2 QPCR 檢測(cè) AR 表達(dá)變化情況35-37
• 4 討論37-38
• 第二部分 AR 對(duì)視神經(jīng)損傷后 RGCs 存活以及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響研究38-48
• 引言38-39
• 1 材料39-40
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物39
• 1.2 主要試劑39
• 1.3 主要儀器39-40
• 1.4 主要抗體40
• 2 方法40-42
• 2.1 AR~(-/-)YFP 小鼠的交配及鑒定40-41
• 2.2 小鼠視神經(jīng)橫斷損傷模型的制備（同第一部分實(shí)驗(yàn)）41
• 2.3 組織準(zhǔn)備41-42
• 2.4 圖像采集及分析42
• 2.5 石蠟切片和蘇木精-伊紅染色42
• 2.6 免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)（同第一部分實(shí)驗(yàn)）42
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)（同第一部分實(shí)驗(yàn)）42
• 3 結(jié)果42-46
• 3.1 AR~(+/+)YFP 和 AR~(-/-)YFP 小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活情況比較42-44
• 3.2 AR~(-/-)和 AR~(+/+)小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜組織病理變化情況44-45
• 3.3 AR 對(duì)小鼠視神經(jīng)橫斷損傷后 GAP-43 表達(dá)的影響45-46
• 4 討論46-48
• 小結(jié)48-50
• 參考文獻(xiàn)50-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果60-61
• 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳鵬;郭宏敏;鄭晶晶;于才勇;劉芳芳;卞干蘭;鐘金淑子;鞠躬;王鍵;;醛糖還原酶在小鼠損傷脊髓小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及其作用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年02期

  本文關(guān)鍵詞：醛糖還原酶在視神經(jīng)損傷后的表達(dá)和作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：418930