目的 :探究組蛋白去乙�；福╤istone deacetylases, HDACs）在斑馬魚視網(wǎng)膜針刺損傷后的表達(dá)及其在視網(wǎng)膜再生中的作用。方法:（1）通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）檢測視網(wǎng)膜損傷后HDACs的mRNA表達(dá)水平;（2）5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU）免疫熒光分析視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞（Müller glia, MG）和祖細(xì)胞（MG-derived progenitor cells, MGPCs）的增殖;（3）利用在去分化MG中特異表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的Tg（1016tuba1a:GFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚檢測MG細(xì)胞的去分化;（4）通過BrdU譜系追蹤MGPCs并進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）免疫熒光分析MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程;（5）qPCR檢測抑制HDACs后視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果:（1）視... 

【文章來源】：南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2020,40(04)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

hdac基因在斑馬魚視網(wǎng)膜針刺損傷后的表達(dá)

已有研究[13-14]證實(shí)斑馬魚視網(wǎng)膜損傷后4 dpi內(nèi)核層(inner nuclear layers,INL)中Brd U+的細(xì)胞是多能性的MGPCs。為進(jìn)一步研究HDACs在視網(wǎng)膜再生中的功能，利用HDACs的抑制劑TSA和VPA來抑制HDACs的作用。斑馬魚在視網(wǎng)膜損傷后每日腹腔注射溶劑對照二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)或不同濃度的TSA(0.05、0.5和5μmol/L)和VPA(2、20和200μmol/L)，在4 dpi先腹腔注射Brd U標(biāo)記MG-PCs,3 h后收取眼球并進(jìn)行冰凍切片。Brd U免疫熒光染色顯示TSA和VPA處理劑量依賴的減少了4 dpi INL Brd U+細(xì)胞的數(shù)量(圖2)，提示斑馬魚視網(wǎng)膜損傷后MGPCs的形成需要HDACs。2.3 HDACs促進(jìn)斑馬魚視網(wǎng)膜MG的增殖

為了解HDACs是否影響MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程，本研究進(jìn)行了譜系追蹤實(shí)驗(yàn)。在2 dpi腹腔注射Brd U標(biāo)記增殖的MGPCs，然后在4 dpi通過冰凍切片進(jìn)行PCNA免疫熒光染色(圖4A)。在4 dpi視網(wǎng)膜內(nèi)PCNA+Brd U+細(xì)胞數(shù)量/Brd U+細(xì)胞數(shù)量的比值可以反映Brd U標(biāo)記的MGPCs后代在4 dpi時仍處于細(xì)胞周期中的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TSA處理顯著降低了該比值(圖4B～C)，提示MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程是需要HDACs的。進(jìn)一步通過q PCR分析了TSA對視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響，q PCR結(jié)果顯示TSA處理導(dǎo)致p21、p27和p57 3個周期素依賴激酶抑制物(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的表達(dá)顯著升高，而細(xì)胞周期素ccnd1的表達(dá)顯著下調(diào)(圖4D)，這與觀察到的增殖抑制表型相一致。TSA處理也導(dǎo)致2 dpi細(xì)胞周期素ccna2和ccne1的表達(dá)升高(圖4D)。這些結(jié)果顯示TSA處理干擾了細(xì)胞周期相關(guān)基因的正常表達(dá)，提示HDACs可能通過影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程。3 討論

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Expression of SoxC Transcription Factors during Zebrafish Retinal and Optic Nerve Regeneration[J]. Zhaoxia Mu,Shuqiang Zhang,Chunjiao He,Haitao Hou,Dong Liu,Nan Hu,Hui Xu.  Neuroscience Bulletin. 2017(01)



本文編號：3399373