目的 :探究組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）在斑馬魚視網膜針刺損傷后的表達及其在視網膜再生中的作用。方法:（1）通過定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）檢測視網膜損傷后HDACs的mRNA表達水平;（2）5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU）免疫熒光分析視網膜Müller細胞（Müller glia, MG）和祖細胞（MG-derived progenitor cells, MGPCs）的增殖;（3）利用在去分化MG中特異表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的Tg（1016tuba1a:GFP）轉基因斑馬魚檢測MG細胞的去分化;（4）通過BrdU譜系追蹤MGPCs并進行增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）免疫熒光分析MGPCs的細胞周期進程;（5）qPCR檢測抑制HDACs后視網膜內細胞周期相關基因的表達變化。結果:（1）視... 

【文章來源】：南通大學學報(醫(yī)學版). 2020,40(04)

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【部分圖文】：

hdac基因在斑馬魚視網膜針刺損傷后的表達

已有研究[13-14]證實斑馬魚視網膜損傷后4 dpi內核層(inner nuclear layers,INL)中Brd U+的細胞是多能性的MGPCs。為進一步研究HDACs在視網膜再生中的功能，利用HDACs的抑制劑TSA和VPA來抑制HDACs的作用。斑馬魚在視網膜損傷后每日腹腔注射溶劑對照二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)或不同濃度的TSA(0.05、0.5和5μmol/L)和VPA(2、20和200μmol/L)，在4 dpi先腹腔注射Brd U標記MG-PCs,3 h后收取眼球并進行冰凍切片。Brd U免疫熒光染色顯示TSA和VPA處理劑量依賴的減少了4 dpi INL Brd U+細胞的數(shù)量(圖2)，提示斑馬魚視網膜損傷后MGPCs的形成需要HDACs。2.3 HDACs促進斑馬魚視網膜MG的增殖

為了解HDACs是否影響MGPCs的細胞周期進程，本研究進行了譜系追蹤實驗。在2 dpi腹腔注射Brd U標記增殖的MGPCs，然后在4 dpi通過冰凍切片進行PCNA免疫熒光染色(圖4A)。在4 dpi視網膜內PCNA+Brd U+細胞數(shù)量/Brd U+細胞數(shù)量的比值可以反映Brd U標記的MGPCs后代在4 dpi時仍處于細胞周期中的比例。實驗結果顯示TSA處理顯著降低了該比值(圖4B～C)，提示MGPCs的細胞周期進程是需要HDACs的。進一步通過q PCR分析了TSA對視網膜內細胞周期相關基因表達的影響，q PCR結果顯示TSA處理導致p21、p27和p57 3個周期素依賴激酶抑制物(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的表達顯著升高，而細胞周期素ccnd1的表達顯著下調(圖4D)，這與觀察到的增殖抑制表型相一致。TSA處理也導致2 dpi細胞周期素ccna2和ccne1的表達升高(圖4D)。這些結果顯示TSA處理干擾了細胞周期相關基因的正常表達，提示HDACs可能通過影響細胞周期相關基因的表達調控MGPCs的細胞周期進程。3 討論

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Expression of SoxC Transcription Factors during Zebrafish Retinal and Optic Nerve Regeneration[J]. Zhaoxia Mu,Shuqiang Zhang,Chunjiao He,Haitao Hou,Dong Liu,Nan Hu,Hui Xu.  Neuroscience Bulletin. 2017(01)



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