本文關(guān)鍵詞：mTOR在TGF-β_2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：晶狀體上皮細(xì)胞(Lens epithelial cells, LECs)對(duì)晶狀體的生長(zhǎng)發(fā)育、維持晶狀體的正常生理功能至關(guān)重要。LECs生長(zhǎng)、增殖、移行、分化和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的等方面的異常是多種晶狀體疾病特別是后囊膜混濁(posterior capsular opacification, PCO)的基礎(chǔ)[1]。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor β,TGF-β)是上皮細(xì)胞向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)的關(guān)鍵因子[2],現(xiàn)有研究表明,在TGF-p的幾種亞型中,TGF-β2在房水中含量最高,且能有效誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞(Human lens epithelial cells HLECs)發(fā)生EMT[3],目前已成為研究PCO時(shí)細(xì)胞模型的常用建造工具[4]。 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種非典型的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程中發(fā)揮中心樞紐的作用[5]。此外,mTOR能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附與移行,參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6],但是,mTOR是否在LECs中存在表達(dá),以及mTOR在HLECs向間葉樣轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的活化水平及其是否參與調(diào)節(jié)HLECs(?)司葉樣轉(zhuǎn)化至今尚未見報(bào)道。 目的 明確mTOR在TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的活化情況(磷酸化水平S2448-P,S2481-P)及作用。 方法 1建立TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的EMT體外培養(yǎng)體系 培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基后,加入TGF-β2,使其終濃度為10ng/ml,分別培養(yǎng)0h、1h、6h、12h、24h、48h,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,western blot法檢測(cè)HLECs上皮細(xì)胞標(biāo)志物縫隙連接蛋白43(connexin43, Cx43)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin, E-cad)和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物纖維連接蛋白(fibronectin, FN)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin, α-SMA)的表達(dá)水平。 2western blot法檢測(cè),mTOR及其磷酸化水平(S2448-P,S2481-P)在TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs的EMT過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。 3觀察mTOR在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的EMT過(guò)程中的活化水平及其作用 3.1確定mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794的最佳作用濃度。 將濃度梯度為0nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794分別加入HLECs-B3細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,western blot法檢測(cè)mTOR及其磷酸化水平(S2448-P,S2481-P)。根據(jù)二者對(duì)mTOR磷酸化水平的抑制情況以及細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),選擇下一步實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素和KU-0063794的作用濃度。 3.2觀察mTOR在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的EMT過(guò)程中的活化水平以及mTOR抑制劑對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。 3.2.1將實(shí)驗(yàn)分為以下組： 對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后,換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24h。 TGF-p2組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后,換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基后,終濃度為l0ng/ml TGF-β2處理24h。 雷帕霉素組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,最佳濃度的雷帕霉素(最佳濃度由上述實(shí)驗(yàn)3得到)處理24h。 KU-0063794組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,最佳濃度的KU-0063794(最佳濃度由上述實(shí)驗(yàn)3得到)處理24h。 雷帕霉素+TGF-82組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,最佳濃度的雷帕霉素預(yù)處理1h后,10ng/ml TGF-β2處理24h。 KU-0063794+TGF-β2組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,最佳濃度的KU-0063794預(yù)處理1h后,10ng/ml TGF-β2處理24h。 TGF-β2+雷帕霉素組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,終濃度為10ng/ml TGF-β2處理24h誘導(dǎo)HLECs,待HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化后,再加入最佳濃度的雷帕霉素處理24h。 TGF-β2+KU-0063794組：常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系,生長(zhǎng)至80%融合后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,10ng/ml TGF-β2處理24h誘導(dǎo)HLECs,待HLECs(?)司葉樣轉(zhuǎn)化后,再加入最佳濃度的KU-0063794處理24h。 3.2.2western blot法檢測(cè)mTOR的表達(dá)及其磷酸化水平(S2448-P,S2481-P)。 3.2.3western blot法檢測(cè)各組上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cad、Cx43,和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志FN、α-SMA的表達(dá)水平。 4所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以■±s表示,利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本摘要“方法”部分“1”,“2”,“3.1”項(xiàng)中所述的western blot實(shí)驗(yàn)均采用One-way ANOVA分析,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的兩兩比較采用Dunnett t法。本摘要“方法”部分“3.2.2”和“3.2.3””項(xiàng)中所述的western blot實(shí)驗(yàn)采用One-way ANOVA分析,LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1在10ng/ml TGF-β2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,HLECs從類橢圓形、多角形逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,且細(xì)胞間隙增大。與未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs相比,E-cad和Cx43分別于培養(yǎng)的第6h和12h時(shí)表達(dá)開始下降(E-cad：1.059±0.004,P=0.000；Cx43：0.477±0.076,P=0.032),FN和α-SMA于24h時(shí)表達(dá)開始增高(FN：0.872±0.134,p=0.011；α-SMA：0.516±0.049,P=0.000)。 2在10ng/ml TGF-β2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中,mTOR在2448和2481位點(diǎn)的磷酸化水平從培養(yǎng)的6h開始增高(S2448-P：0.542±0.124,P=0.006,S2481-P：0.519±0.122,P=0.006),并呈時(shí)間依賴性的磷酸化程度上調(diào),在24h時(shí)達(dá)到最高水平,但mTOR總表達(dá)量沒(méi)有變化。 3mTOR(?)印制劑可阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化 3.1倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),使用雷帕霉素或KU-0063794處理HLECs,隨著雷帕霉素和KU-0063794的濃度增高,貼壁HLECs數(shù)量減少,漂浮細(xì)胞增多,濃度為300nM的KU-0063794處理HLECs24h后,細(xì)胞密度稀疏,濃度為1000nM的KU-0063794處理HLECs24h后,細(xì)胞接近全部漂浮死亡。Western blot顯示10nM的雷帕霉素和KU-0063794均能抑制nTOR(S2448-P, S2481-P)的磷酸化水平,且成一定的濃度依賴性,但各濃度的雷帕霉素和KU-0063794均不影響mTOR的總表達(dá)量。結(jié)合形態(tài)學(xué),當(dāng)KU-0063794濃度高于100nM時(shí),貼壁HLECs稀疏,難以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)處理,故選擇100nM雷帕霉素和KU-0063794進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 3.2mTOR抑制劑可阻斷TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化 3.2.1mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs內(nèi)nTOR磷酸化激活 與對(duì)照組相比,“TGF-p2組”的HLECs內(nèi)mTOR被磷酸化激活(S2448-P為0.884±0.015,P=0.000；S2481-P為0.874±0.115,P=0.000),而“雷帕霉素+TGF-β2組”和“KU-0063794+TGF-p2組”中,TGF-p2引起的HLECs內(nèi)mTOR磷酸化激活被抑制,(“雷帕霉素+TGF-p2組”與“TGF-p2組”相比mTOR S2448-P及S2481-P：P=0.000；“KU-0063794+TGF-p2組”與“TGF-p2組”相比mTORS2448-P及S2481-P：P=0.000)。與“TGF-p2組”相比,“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中已完成EMT的HLECs中mTOR磷酸化仍被抑制(“TGF-β2+雷帕霉素組”與“TGF-β2組”相比,mTORS2448-P及S2481-P：P=0.000；“TGF-p2+KU-0063794組”與“TGF-p2組”相比mTORS2448-P及S2481-P：P=0.000)。但是,“TGF-β2+雷帕霉素組”的mTORmTORmTORS2448-P及S2481-P：P=0.000；TGF-β2+KU-0063794組與KU-0063794+TGF-β2組相比,mTOR S2448-P及S2481-P：P=0.000)。KU-0063794對(duì)TGF-p2誘導(dǎo)HLECs中mTOR磷酸化的抑制效果強(qiáng)于雷帕霉素(“KU-0063794+TGF-β2組”與“雷帕霉素+TGF-p2組”相比以及“TGF-β2+KU-0063794組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比InTOR S2448-P、S2481-P:P=0.000)。 3.2.2雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs內(nèi)上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43、E-cad的表達(dá)下降以及間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN、α-SMA的表達(dá)升高。 “對(duì)照組”HLECs中表達(dá)豐富的E-cad、Cx43以及微量的FN和α-SMA、“雷帕霉素組”或“KU-0063794組”中上皮／間葉樣標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平與“對(duì)照組”無(wú)差別(“雷帕霉素組”與“對(duì)照組”相比,E-cadP=0.863,Cx43P=0.807,FNP=0.859、a-SMA P=0.782；“KU-0063794組”與“對(duì)照組”相比,E-cadP=0.773,Cx43P=0.834,FN P=0.395、α-SMA P=0.245)�！癟GF-β2組”中E-cad、Cx43表達(dá)較“對(duì)照組”下降,而FN、a-SMA的表達(dá)升高(“TGF-β2組”與“對(duì)照組”相比,4種標(biāo)志蛋白P=0.000)�！袄着撩顾�+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比,E-cad、Cx43表達(dá)增多,FN、α-SMA表達(dá)減少(4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000)；“KU-0063794+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比,E-cad、Cx43表達(dá)增多,FN以及a-SMA表達(dá)減少(4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000)。與“TGF-β2組”相比,“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中E-cad、Cx43表達(dá)量升高、FN以及a-SMA表達(dá)下降(與“TGF-β2組”相比,“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000)�！癟GF-β2+雷帕霉素組”中E-cad、Cx43的表達(dá)量少于“對(duì)照組”, FN以及α-SMA表達(dá)量高于“對(duì)照組”(4種標(biāo)志蛋白均為均為P=0.000)�！癟GF-β2+KU-0063794組”中]FN表達(dá)量與“對(duì)照組”相當(dāng)(FN P=0.071),但E-cad及Cx43表達(dá)量低于“對(duì)照組”,a-SMA表達(dá)量高于“對(duì)照組”(E-cadP=0.017、Cx43P=0.001以及a-SMA P=0.000)�！癟GF-β2+雷帕霉素組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比,E-cad與Cx43的表達(dá)量少,而FN及a-SMA的表達(dá)量多(4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000)�！癟GF-β2+KU-0063794組”與“KU-0063794+TGF-β2組”相比,E-cad表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.063),但Cx43的表達(dá)量減少(p=0.003),FN和α-SMA的表達(dá)量增多(P=0.000)�！癒U-0063794+TGF-β2組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比,E-cad及Cx43的表達(dá)量增多,而FN與a-SMA的表達(dá)量減少(E-cad P=0.006,Cx43p=0.012,FN與α-SMA均為P=0.000),“TGF-β2+KU-0063794組”中E-cad和Cx43的表達(dá)也高于“TGF-β2+雷帕霉素組”, FN及α-SMA表達(dá)量也低于“TGF-β2+雷帕霉素組”,(E-cad,FN及a-SMA均為p=0.000、Cx43P=0.014)。 結(jié)論 110ng/ml的TGF-β2能有效誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化 210ng/ml的TGF-β2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中,HLECs內(nèi)mTOR磷酸化激活,但mTOR總量未受影響。 310nM的雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制mTOR(S2448-P,S2481-P)的磷酸化水平,且成濃度依賴性,但均不影響mTOR總表達(dá)量。 41OOnM的雷帕霉素和KU-0063794預(yù)處理HLECs均能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs內(nèi)mTOR磷酸化激活以及TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化。100nM的雷帕霉素和KU-0063794能部分逆轉(zhuǎn)TGF-p2誘導(dǎo)的HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化,但使用1OOnM雷帕霉素或KU-0063794預(yù)處理再用TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs比先用TGF-β2誘導(dǎo)再使用雷帕霉素或KU-0063794的細(xì)胞更能維持上皮細(xì)胞特性。KU-0063794抑制或者是逆轉(zhuǎn)TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs內(nèi)mTOR(S2448-P,S2481-P)的磷酸化激活、以及HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化的效果均強(qiáng)于雷帕霉素。
【關(guān)鍵詞】：晶狀體上皮細(xì)胞 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/mTOR 上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)化/EMT
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R77
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 前言17-24
• 1. 晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)：晶狀體混濁的發(fā)生基礎(chǔ)17
• 2. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β_2誘導(dǎo)LECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymaltransition,EMT)：白內(nèi)障研究的細(xì)胞模型17-18
• 3. 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)：細(xì)胞新陳代謝的中心樞紐18-22
• 4. 新的假說(shuō)：mTOR參與調(diào)控LECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化22-24
• 第二章 材料與方法24-34
• 1. 材料24-28
• 2. 方法28-34
• 第三章 結(jié)果34-50
• 1. TGF-β_2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化的體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建34-37
• 2. mTOR及其磷酸化水平在TGF-β_2誘導(dǎo)HLECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程的動(dòng)態(tài)表達(dá)37-39
• 3. mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794的最佳作用濃度的選擇39-44
• 4. mTOR抑制劑可阻斷TGF-β_2誘導(dǎo)HLECs的向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化44-50
• 第四章 討論50-55
• 第五章 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 綜述61-70
• References67-70
• 在讀期間發(fā)表的論文70-71
• 致謝71-73
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 高雪;蔡可麗;吳曉莉;楊雪麗;霍偉;;雷帕霉素抑制兔眼后發(fā)性白內(nèi)障的實(shí)驗(yàn)研究[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年06期

2 鄭鵬生;冀靜;;mTOR信號(hào)通路與腫瘤的研究進(jìn)展[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年01期

3 鐘彥彥;張海峰;陸曉和;;雷帕霉素滴眼劑抑制大鼠角膜血管新生:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及炎癥因子的作用[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年15期

4 郭�？�;金海鷹;王麗婭;張洪洋;楊鑫;金海燕;;晶狀體上皮細(xì)胞端粒酶活性及細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究[J];眼科研究;2005年06期

5 葉盼盼;姚克;譚健;湯霞靖;;TGF-β_2對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];眼科研究;2007年11期

6 才娜;劉寧寧;柳力敏;萬(wàn)超;王昕華;陳蕾;;雷帕霉素靶分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變中的表達(dá)及意義[J];眼科新進(jìn)展;2010年02期

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本文編號(hào)：336081