本課題前期研究工作基礎(chǔ)NOR1是本實(shí)驗(yàn)室自主克隆的鼻咽癌易感基因,在鼻咽癌組織中顯著下調(diào),但其下調(diào)機(jī)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律尚未闡明。NOR1蛋白定位于線粒體和胞漿中,與OSCP蛋白存在直接交互作用；NOR1表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長與增殖,并促進(jìn)缺氧引起的細(xì)胞凋亡。但該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究的還未成熟。定位克隆NOR1基因的核心啟動子采用預(yù)測軟件PromoterScan、PromoterInspector和EMBOSS CpG Plot綜合分析發(fā)現(xiàn),NOR1基因啟動子區(qū)可能位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（為+1）上游-517bp至下游+236bp以內(nèi)。為了確定NOR1基因核心啟動子序列,將NOR1基因的預(yù)測啟動子調(diào)控區(qū)分為幾段,構(gòu)建出一系列NOR1基因不同調(diào)控區(qū)熒光素酶報告載體和綠色熒光蛋白報告載體。通過luciferase assay和熒光顯微鏡觀察聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)NOR1核心啟動子定位于NOR1基因5’端-258/+26區(qū)間內(nèi)。NOR1基因啟動子區(qū)存在一個典型的CpG島,在鼻咽癌組織和細(xì)胞中因啟動子高甲基化修飾而表達(dá)下調(diào)MatInspector軟件分析發(fā)現(xiàn)NOR1基因啟動子區(qū)序列無TATA盒... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要縮略詞簡表
1 前言
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞系和組織樣本
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        2.1.3 試劑
        2.1.4 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 生物信息學(xué)分析
        2.2.2 基因組DNA的提取
        2.2.3 膠回收(按試劑盒說明書步驟進(jìn)行)
        2.2.4 轉(zhuǎn)化反應(yīng)
        2.2.5 載體的構(gòu)建
        2.2.6 質(zhì)粒、siRNA轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞
        2.2.7 慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞
        2.2.8 核心啟動子檢測
        2.2.9 甲基轉(zhuǎn)移酶SssⅠ處理DNA
        2.2.10 凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)
        2.2.11 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)ChIP檢測
        2.2.12 基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾
        2.2.13 亞硫酸氫鈉測序法(Bisulfite Genomic Sequencing,BGS)
        2.2.14 甲基化特異性PCR(Methylated specific PCR,MSP)
        2.2.15 組織及細(xì)胞RNA制備及cDNA的轉(zhuǎn)錄
        2.2.16 差異RT-PCR
        2.2.17 細(xì)胞蛋白制備
        2.2.18 Western blot檢測
        2.2.19 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.2.20 流式細(xì)胞術(shù)檢測基因蛋白表達(dá)水平
        2.2.21 腫瘤細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)
        2.2.22 軟瓊脂集落生成實(shí)驗(yàn)
        2.2.23 MTT法檢測細(xì)胞活力
        2.2.24 MTT法檢測藥物對細(xì)胞毒性的IC50
        2.2.25 LDH法測量細(xì)胞毒性
        2.2.26 TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡
        2.2.27 Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡
        2.2.28 乳酸生成實(shí)驗(yàn)
        2.2.29 耗氧量檢測
        2.2.30 ROS檢測
        2.2.31 統(tǒng)計學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 NOR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律及氧化應(yīng)激敏感性表達(dá)
        3.1.1 NOR1基因啟動子的定位及克隆
        3.1.2 NOR1基因在鼻咽癌中甲基化沉默
        3.1.3 NOR1基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及氧化應(yīng)激敏感性表達(dá)
    3.2 NOR1對鼻咽癌生物學(xué)行為的影響
        3.2.1 NOR1基因抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長和增殖
        3.2.2 NOR1基因抑制惡性腫瘤細(xì)胞自噬分子表達(dá)和自噬行為
        3.2.3 NOR1表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的能量代謝
    3.3 NOR1基因?qū)ρ趸瘧?yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞自噬/凋亡分子開關(guān)的調(diào)節(jié)
        3.3.1 NOR1增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞毒性,降低細(xì)胞活力
        3.3.2 NOR1通過抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,促進(jìn)細(xì)胞凋亡
        3.3.3 NOR1增加化腫瘤細(xì)胞的化療敏感性
4 討論
    4.1 抑癌基因NOR1是一個在鼻咽癌中甲基化沉默的氧化應(yīng)激反應(yīng)性蛋白
        4.1.1 抑癌基因NOR1啟動子在鼻咽癌中甲基化沉默
        4.1.2 抑癌基因NOR1是一個氧化應(yīng)激反應(yīng)性蛋白,功能與氧化應(yīng)激相關(guān)
    4.2 抑癌基因NOR1的生物學(xué)功能
        4.2.1 抑癌基因NOR1同時抑制腫瘤生長和自噬
        4.2.2 抑癌基因NOR1通過抑制自噬來抑制腫瘤細(xì)胞能量代謝,發(fā)揮抑癌的作用
    4.3 抑癌基因NOR1通過抑制細(xì)胞自噬,促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡
    4.4 抑癌基因NOR1通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡
    4.5 抑癌基因NOR1與順鉑協(xié)同抑制自噬,增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對順鉑的化療敏感性
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間主要研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3207948