本文關(guān)鍵詞：TLR7激動(dòng)劑CL097對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎中Th17細(xì)胞的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的人類(lèi)自身免疫性葡萄膜炎是一類(lèi)嚴(yán)重的炎癥性致盲眼病,近年研究認(rèn)為輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),在一些自身免疫性疾病的發(fā)展過(guò)程中Toll樣受體7(TLR7)可以影響Th17細(xì)胞的分化,但TLR7在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)中是否可以通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)調(diào)控Th17細(xì)胞的作用機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。CL097是一種能夠活化TLR7的激動(dòng)劑,本研究主要探究TLR7激動(dòng)劑CL097處理的小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)對(duì)EAU中光感受器間維生素A類(lèi)結(jié)合蛋白(IRBP)1-20-特異性Th17細(xì)胞的影響,并初步探討其可能的分子機(jī)制。方法首先通過(guò)體外重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rm GM-CSF)及重組小鼠白細(xì)胞介素(rm IL)-4(rm IL-4)定向誘導(dǎo)BMDCs,并應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定BMDCs。第6天向BMDCs中加入5μg/ml CL097作用8h,對(duì)照組加入等體積PBS,采用實(shí)時(shí)熒光(RT)-PCR技術(shù)檢測(cè)CL097處理組與對(duì)照組BMDCs中IL-6,IL-23,IL-1β以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β(TGF-β)m RNA的相對(duì)表達(dá)量。將IRBP 1-20多肽片段與等體積含有結(jié)核桿菌素H37RA的弗氏完全佐劑(CFA)混合并充分乳化后主動(dòng)免疫C57BL/6小鼠,利用間接檢眼鏡觀察小鼠眼底炎癥表現(xiàn),并參照Caspi評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行炎癥評(píng)分。免疫后第13天取C57BL/6小鼠的眼球制作病理切片,并用蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。同時(shí)分離得到C57BL/6小鼠脾臟及淋巴結(jié)中IRBP1-20-特異性T細(xì)胞,并與CL097處理組及對(duì)照組BMDCs共培養(yǎng)至第5天,收集細(xì)胞。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IL-17,γ干擾素(IFN-γ),維甲酸受體相關(guān)孤兒受體(ROR)γt(RORγt)和T盒21轉(zhuǎn)錄因子(T-bet)m RNA的相對(duì)表達(dá)量以及采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1及Th17細(xì)胞的比率變化。將培養(yǎng)至第6天得到的高純度BMDCs隨機(jī)分為6組,并用CL097分別處理0h、0.25h、0.5h、1h、3h、6h,之后利用western blot檢測(cè)各組BMDCs中p-p38,p-ERK1/2,p-JNK的蛋白表達(dá)量。結(jié)果1、定向誘導(dǎo)BMDCs的第6天,流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示BMDCs純度可達(dá)90%。2、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,BMDCs經(jīng)CL097處理后IL-6、IL-23、IL-1βm RNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(t=4.560,P=0.045;t=5.476,P=0.032;t=17.24,P=0.003),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TGF-βm RNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(t=10.41,P=0.009),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、主動(dòng)免疫后第13天成功建立小鼠EAU模型。4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)CL097處理組BMDCs與IRBP1-20-特異性T細(xì)胞共培養(yǎng)后第5天,與對(duì)照組相比,Th17細(xì)胞比例由(10.240±3.173)%升至(17.750±4.793)%(t=4.938,P=0.039),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.938,P=0.039)。但Th1細(xì)胞比例為(1.123±0.356)%,較對(duì)照組(1.060±0.384)%基本無(wú)變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.714,P=0.113)。5、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,CL097處理組BMDCs與IRBP1-20-特異性T細(xì)胞共培養(yǎng)后第5天,與對(duì)照組相比,RORγt和IL-17 m RNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高(t=8.844,P=0.013;t=8.831,P=0.013),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而T-bet,IFN-γm RNA相對(duì)表達(dá)量基本變化不大(t=2.078,P=0.173;t=1.082,P=0.393),差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6、western blot結(jié)果顯示經(jīng)CL097刺激后,BMDCs中p-p38的蛋白表達(dá)量?jī)H在0.25h較對(duì)照組0h顯著升高,之后恢復(fù)至0h水平;p-ERK1/2在0.25h、0.5h表達(dá)顯著升高后又恢復(fù)至0h水平;p-JNK在0.25h、0.5h、1h表達(dá)顯著升高后又恢復(fù)至0h水平。結(jié)論1、在體外,TLR7激動(dòng)劑CL097能夠影響B(tài)MDCs分泌與Th17細(xì)胞極化相關(guān)的細(xì)胞因子,并間接促進(jìn)EAU中Th17細(xì)胞的分化。2、TLR7激動(dòng)劑CL097可能是通過(guò)活化BMDCs中MAPKs(p38、ERK1/2和JNK)信號(hào)通路來(lái)間接促進(jìn)EAU中Th17細(xì)胞的分化。
【關(guān)鍵詞】：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎 Toll樣受體7 抗原特異性T細(xì)胞 Th17細(xì)胞 樹(shù)突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R773.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料14-17
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備14-15
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑15-17
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑配制17
• 1.2 方法17-36
• 1.2.1 小鼠BMDCs的制備17-19
• 1.2.2 小鼠BMDCs總RNA提取19-20
• 1.2.3 測(cè)小鼠BMDCs總RNA的濃度20
• 1.2.4 小鼠BMDCs總RNA逆轉(zhuǎn)錄20-21
• 1.2.5 RT-PCR21-23
• 1.2.6 EAU模型的建立23-24
• 1.2.7 IRBP120特異性T細(xì)胞的制備24-25
• 1.2.8 IRBP120特異性T細(xì)胞與BMDCs共培養(yǎng)25-26
• 1.2.9 RT-PCR檢測(cè)共培養(yǎng)的IRBP120特異性T細(xì)胞相關(guān)基因變化26-27
• 1.2.10 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17和Th1細(xì)胞的比率27-29
• 1.2.11 細(xì)胞蛋白樣品的制備29-30
• 1.2.12 BCA法測(cè)定蛋白濃度30
• 1.2.13 western blot檢測(cè)p-p38、p-ERK1/2以及p-JNK30-36
• 1.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理36
• 1.3 結(jié)果36-42
• 1.3.1 BMDCs形態(tài)學(xué)觀察與鑒定36-37
• 1.3.2 EAU模型的鑒定37-38
• 1.3.3 各組BMDCs分泌與Th17細(xì)胞極化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化38-39
• 1.3.4 各組BMDCs對(duì)Th17及Th1細(xì)胞分化的影響39-40
• 1.3.5 共培養(yǎng)后，與Th17及Th1細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化40-41
• 1.3.6 CL097刺激后BMDCs后p-p38、p-JNK及p-ERK1/2表達(dá)情況41-42
• 1.4 討論42-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明53-54
• 綜述54-64
• 綜述參考文獻(xiàn)61-64
• 致謝64

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

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6 孫

本文編號(hào)：315267