本文關(guān)鍵詞：HIV-1破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞屏障功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),它是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)引起的一種病死率極高的惡性傳染病。HIV病毒侵入人體后會持續(xù)復制和傳播,逐步導致CD4+細胞的減少以及人體免疫系統(tǒng)的破壞,從而并發(fā)一系列機會性感染以及腫瘤。根據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署最新的數(shù)據(jù)顯示,截至2011年末,全世界共有3420萬名HIV感染者。我國艾滋病的防治工作也處于非常關(guān)鍵的時期,根據(jù)衛(wèi)生部的統(tǒng)計,截至2012年10月底,全國累計報告艾滋病病毒感染者和病人492191例,存活的感染者和病人383285例。由于全世界每年在HIV/AIDS患者治療上的投入不斷增加以及高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方法(Highly active antiretroviral therapy, HAART)的普及應(yīng)用,艾滋病已經(jīng)成為一種可控的慢性疾病。同時由于艾滋病人的壽命延長,死亡率大大下降,感染者或發(fā)病者所面臨的各種并發(fā)癥就極大的影響了病人的生存質(zhì)量。 眼部疾病是HIV/AIDS患者常見的并發(fā)癥,流行病學研究表明,大約50%-75%的HIV感染者合并有眼部病變。HIV視網(wǎng)膜病變是HIV/AIDS患者常見的眼部病變之一,該病發(fā)生較早,甚至有少數(shù)患者作為首發(fā)癥狀就醫(yī)；累及人群廣泛,發(fā)病率與CD4+細胞的數(shù)量密切關(guān)聯(lián),CD4+T淋巴細胞的數(shù)量越少,視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率就越高。HIV視網(wǎng)膜病變可以表現(xiàn)為后極部的棉絮狀白斑、視網(wǎng)膜出血、毛細血管瘤、血管擴張、視網(wǎng)膜壞死以及視網(wǎng)膜脫落等。其病理特征包括視網(wǎng)膜微血管滲漏、神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、內(nèi)皮細胞腫脹、基底膜增厚等。視網(wǎng)膜病變可以導致HIV/AIDS患者的視力受損,嚴重的患者甚至會因此而失明,從而給患者的生活質(zhì)量帶來了很大的影響。 研究表明在HIV感染者的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、視網(wǎng)膜組織內(nèi)部的各層細胞中均能檢測到HIV的抗原,因此,HIV侵入視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)被認為是導致HIV視網(wǎng)膜病的主要原因。血-視網(wǎng)膜屏障(Blood retinal barrier, BRB)是血眼屏障的重要組成部分,它是存在于視網(wǎng)膜神經(jīng)組織與血液之間的具有選擇通透性的組織結(jié)構(gòu)。正常情況下血-視網(wǎng)膜屏障保護著視網(wǎng)膜組織,使視網(wǎng)膜組織不受病原微生物的侵襲。那么HIV是如何侵入人血-視網(wǎng)膜屏障,從而導致視網(wǎng)膜并發(fā)癥的呢? HIV具有神經(jīng)嗜性,神經(jīng)系統(tǒng)是HIV的病毒儲藏庫之一�，F(xiàn)有治療手段完全清除HIV感染者體內(nèi)的病毒是非常困難的,一旦HAART治療停藥,即使是極少數(shù)的潛伏感染細胞也可能會導致復發(fā),病毒重新啟動復制進而使HIV感染者加速進入艾滋病發(fā)病期,這種情況與腫瘤復發(fā)較為相似。視網(wǎng)膜作為神經(jīng)系統(tǒng)的一部分,其內(nèi)層的神經(jīng)節(jié)細胞(Ganglion cell, GC)、穆勒膠質(zhì)細胞(Muller glial cell, MGC)可支持HIV的復制,被認為致使視網(wǎng)膜成為HIV的儲藏庫。因此深入探索HIV如何進入血-視網(wǎng)膜屏障,對于了解HIV如何建立視神經(jīng)的潛伏感染具有積極的意義。 血-視網(wǎng)膜屏障由外屏障和內(nèi)屏障兩部分構(gòu)成,其中外屏障主要是由視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Retinal pigment epithelium, RPE)以及相鄰細胞間緊密連接(Tight junctions, TJs)組成。本課題以常用的視網(wǎng)膜色素上皮細胞株D407為研究對象,建立體外血-視網(wǎng)膜外屏障模型,觀察HIV對D407細胞的活性、緊密連接蛋白的表達及功能、血-視網(wǎng)膜外屏障的通透性的影響,探討病毒包膜蛋白gp120在HIV-1影響視網(wǎng)膜色素上皮細胞屏障功能中的作用,并進一步從細胞炎癥因子的角度探索HIV入侵血-視網(wǎng)膜外屏障的可能機制,最后探討HIV-1透過D407細胞層感染靶細胞的作用及與細菌的共感染作用。 目的： 在體外使用D407細胞系構(gòu)建血-視網(wǎng)膜外屏障模型,觀察不同受體嗜性的HIV-1病毒株對視網(wǎng)膜色素上皮細胞屏障功能的影響,進一步利用包含包膜蛋白的HIV-1假病毒以及HIVJR-FL gp120探討gp120在HIV-1影響視網(wǎng)膜色素上皮細胞屏障功能中的作用,分析細胞炎癥因子在此過程中所起到的作用,從而初步揭示HIV-1進入血-視網(wǎng)膜外屏障的途徑,最后探討HIV-1透過D407細胞層感染靶細胞的作用及與細菌的共感染作用。本研究為HIV視網(wǎng)膜病的發(fā)病機制以及臨床防治提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。 方法： 1.感染性克隆病毒和假病毒的制備以及病毒顆粒的濃縮純化 (1)將表達NL4-3(X4受體嗜性)病毒全長基因的質(zhì)粒,92th014.12(R5受體嗜性)病毒全長基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至293T細胞中制備感染性克隆病毒。將pNL4-3.1uc.R-E-和pJR-FL雙質(zhì)粒,pNL4-3.luc.R-E-和pHXB2雙質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至293T細胞制備假病毒。 (2)利用慢病毒濃縮試劑盒純化轉(zhuǎn)染后的病毒液,一方面可以提高病毒滴度,另一方面可以排除病毒液中炎癥因子和其他介質(zhì)對實驗體系的影響。 2.血-視網(wǎng)膜外屏障模型的建立 將生長至對數(shù)期的D407細胞接種于聚酯(PET)膜Transwell透明嵌套上(Corning公司,嵌套膜生長面積4.67cm2,膜孔徑0.4μm),上室加入1.5ml細胞懸液,下室加入2.6ml DMEM培養(yǎng)基,隔天換液直至第6天。每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并用Millicell ERS-2電阻系統(tǒng)測量跨上皮電阻值,當觀察到細胞形成完整致密的單細胞層并且電阻值連續(xù)兩天穩(wěn)定在120±3Ω·cm2時,可認為D407細胞屏障模型成功建立。 3.MTT法檢測HIV-1對D407細胞活性的影響 將D407細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,長至單層后用R5嗜性或X4嗜性的HIV-1原液單獨處理24-72h,然后用MTT法檢測細胞活性,檢測病毒顆粒對D407細胞活力的影響。 4.HIV-1對D407細胞跨上皮電阻值(Transepithelial electrical resistance, TER)的影響 D407細胞屏障模型建立后,分別用不同嗜性的HIV-1顆�；騂IVJR-FL gp120蛋白處理D407細胞,在不同時間點(4h、8h、12h、24h、48h)用Millicell ERS-2電阻系統(tǒng)測量TER值。 5.HIV-1對D407細胞熒光素鈉滲漏比率的影響 D407細胞屏障模型建立后,用R5嗜性或X4嗜性的感染性克隆病毒分別處理D407細胞24h,然后棄去Transwell上室培養(yǎng)基,加入新鮮配制的熒光素鈉溶液(25μg/ml),于0.5h、1h、1.5h、2h分別從Transwell的下室中取出100μl培養(yǎng)基,立即用多功能酶標儀(Tecan)測量熒光值(激發(fā)波長：485nm；發(fā)射波長：535nm)。 6.HIV-1對D407細胞緊密連接蛋白表達的影響 (1)定量RT-PCR法：參考文獻或使用Primer premier5.0軟件設(shè)計緊密連接蛋白基因的引物序列(包括ZO-1、Occludin、Claudin-1、Claudin-2、Claudin-3、 Claudin-4、Claudin-5、Claudin-6、Claudin-7和內(nèi)參基因GAPDH)。用不同嗜性的HIV-1顆�；騂IVJR-FL gp120蛋白分別處理D407細胞24h后,用Trizol提取細胞總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,進行熒光定量PCR實驗,用2-△△CT法計算各基因的相對表達量。 (2) Western Blotting:用不同嗜性的HIV-1顆�；騂IVJR-FL gp120蛋白分別處理D407細胞48h,提取細胞總蛋白,檢測細胞緊密連接蛋白的表達。 (3)細胞免疫熒光法：用R5嗜性或X4嗜性的感染性克隆病毒分別處理D407細胞48h,4%多聚甲醛固定細胞,BSA封閉,分別室溫孵育Occludin抗體(4μg/ml)或ZO-1抗體(2.5μg/ml)2h,然后加入Goat anti-rabbit IgG-FITC(1：200),避光室溫孵育1h, DAPI染色10min,置于熒光顯微鏡下分別觀察Occludin和ZO-1在細胞中的分布。 7.檢測HIV-1透過D407單細胞層的量隨時間變化的規(guī)律 D407細胞屏障模型建立后,將不同嗜性的HIV-1顆粒分別加入到Transwell的上室中,在不同時間點(2h、4h、6h、8h、12h、24h)于Transwell下室中取樣,與等量的5%Triton X-100混合,4℃過夜,ELISA測定下室中p24抗原含量,計算HIV-1的透過率。 8.檢測HIV-1透過D407單細胞層后對下室CD4+細胞的感染力 在Transwell的下室中鋪CD4+細胞,分別為TZM-B1(R5嗜性病毒、X4嗜性病毒的靶細胞)、U87.CD4.CCR5(pseudo-HIVJR-FL的靶細胞)、U87.CD4.CXCR4(pseudo-HIVHXB2的靶細胞),密度為3×104個/孔。第二天在上室中加入不同嗜性的HIV-1顆粒后分別繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24h,然后棄去Transwell小室及上室培養(yǎng)基,72小時后統(tǒng)一用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測化學發(fā)光。 9. ELISA法檢測HIV-1對D407細胞炎癥因子表達的影響 D407細胞屏障模型建立后,用不同嗜性的HIV-1顆�；騂IVJR-FL gp120蛋白分別處理D407細胞24h,收集上清液,用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6、 IL-10、MCP-1/CCL2等炎癥因子的表達。 10.炎癥因子對D407單細胞層屏障功能的影響 D407細胞屏障模型建立后,用Recombinant Human IL-6或Recombinant Human MCP-1處理D407細胞24h, Millicell ERS-2電阻系統(tǒng)測定TER,提取細胞總RNA進行熒光定量PCR實驗,提取總蛋白進行Western blotting實驗。 11.HIV-1破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞導致細菌與病毒的共感染 D407細胞屏障模型建立后,用R5嗜性或X4嗜性的感染性克隆病毒分別處理24h,第二天加入無致病性的大腸桿菌菌株(ATCC number:25922),在不同時間點(3h、6h、12h)于Transwell下室中取樣,將樣品涂布于無抗性的固體瓊脂板中,培養(yǎng)24h后計算細菌的單克隆個數(shù)。 12.統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析和作圖依據(jù)均采用SigmaPlot10.0(數(shù)據(jù)分析和作圖軟件),所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析處理。 結(jié)果： 1.CCR5受體嗜性、CXCR4受體嗜性的兩種感染性克隆病毒在不影響D407細胞活力的情況下可以下調(diào)D407細胞跨細胞電阻值,增加染料熒光素鈉的透過比率,在基因和蛋白水平上下調(diào)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1、 Claudin-2、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-5的表達。 2.假病毒以及HIVJR-FL gp120同樣可以下調(diào)D407細胞的跨細胞電阻值和緊密連接蛋白的表達。而缺失包膜蛋白的病毒顆粒卻對D407細胞的電阻值及緊密連接蛋白的表達沒有影響。 3. ELISA結(jié)果顯示當HIV-1克隆病毒或假病毒處理D407細胞后細胞炎癥因子IL-6和MCP-1/CCL2的表達會上升,但是檢測不到TNF-a和IL-10的表達。采用同濃度的Recombinant Human IL-6或Recombinant Human MCP-1處理D407細胞可以導致D407細胞TER的下調(diào),熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示緊密連接蛋白ZO-1的表達量有所下降。 4.感染實驗和p24含量測定都顯示克隆病毒能透過D407細胞層并感染下層靶細胞,并且HIV-1能協(xié)同細菌侵襲透過D407細胞層。 結(jié)論： HIV-1感染性克隆病毒可以破壞D407細胞間的緊密連接蛋白,導致跨細胞電阻下降,屏障通透性增加,從而影響血-視網(wǎng)膜外屏障的功能,使病毒滲漏侵入視網(wǎng)膜并且仍具有感染力。采用廣泛用于HIV-1入胞機制研究的假病毒以及HIVJR-FL gp120處理D407細胞后也可以觀察到類似的緊密連接蛋白下調(diào)的現(xiàn)象,這進一步說明HIV-1包膜蛋白在其中起到了一定的作用。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)HIV-1病毒可以誘導D407細胞炎癥因子IL-6和MCP-1/CCL2的分泌,而IL-6和MCP-1在體外能下調(diào)緊密連接蛋白ZO-1的表達,結(jié)果初步說明HIV-1病毒誘導D407細胞分泌IL-6和MCP-1/CCL2可能是其能破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)的機制之一。HIV-1破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)能導致細菌的共感染。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 視網(wǎng)膜色素上皮細胞 緊密連接蛋白 炎癥因子 HIV/AIDS視網(wǎng)膜病
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91;R774.1
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-25
• 第一章 HIV-1破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞25-50
• 一、實驗材料及儀器25-27
• 二、實驗方法27-39
• 三、實驗結(jié)果39-48
• 四、小結(jié)48-50
• 第二章 HIV-1包膜蛋白gp120破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞50-57
• 一、實驗材料及儀器50-51
• 二、實驗方法51-52
• 三、實驗結(jié)果52-56
• 四、小結(jié)56-57
• 第三章 HIV-1誘導視網(wǎng)膜色素上皮細胞炎癥因子的釋放57-65
• 一、實驗材料及儀器57
• 二、實驗方法57-59
• 三、實驗結(jié)果59-64
• 四、小結(jié)64-65
• 第四章 HIV-1破壞的視網(wǎng)膜色素上皮細胞導致細菌與病毒的共感染65-72
• 一、實驗材料及儀器65-66
• 二、實驗方法66-68
• 三、實驗結(jié)果68-70
• 四、小結(jié)70-72
• 討論72-79
• 結(jié)論79-80
• 參考文獻80-87
• 縮寫詞中英文對照表87-88
• 論文發(fā)表情況88-89
• 致謝89-91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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  本文關(guān)鍵詞：HIV-1破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞屏障功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：290299