本文關鍵詞：實驗性脈絡膜新生血管中Rap1及相關因子表達的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是多因素參與引起的復雜病理過程,與許多眼底疾病視力嚴重損傷密切相關。然而,由于對CNV的認識起步較晚,其發(fā)病機制及臨床診斷、治療等方面尚存在很多亟待解決的問題。在CNV發(fā)生過程中,視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞起著重要的調(diào)控作用,脈絡膜毛細血管內(nèi)皮細胞是CNV發(fā)生的靶細胞。正常狀態(tài)下,上述兩種關鍵細胞間存在著一個重要的屏障,即Bruch膜。Bruch膜一旦破壞,各種刺激因素可直接或通過RPE細胞間接作用于脈絡膜毛細血管內(nèi)皮細胞,從而引發(fā)CNV。RPE-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體的改變與CNV的形成有關。研究發(fā)現(xiàn),小分子G蛋白Ras超家族的成員Rap1對細胞粘附連接完整性、內(nèi)皮細胞及上皮細胞屏障功能產(chǎn)生重要作用,且調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞對一些促進血管新生刺激因素的反應。那么,Rap1是否可以通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜色素上皮屏障的完整性從而對CNV的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響呢?Rap1在CNV中的表達情況及其與CNV形成的相關性尚不明確,有待于實驗研究加以證明。本研究采用激光誘導建立大鼠CNV模型,分別從組織病理學及分子病理學角度觀察Rap1、GTP-Rap1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和β-連蛋白(β-catenin)在實驗性CNV中的表達情況,驗證GTP-Rap1是否通過介導β-catenin的改變來影響視網(wǎng)膜色素上皮屏障的完整性,探討其在CNV發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制。為今后以Rap1為靶向鞏固視網(wǎng)膜色素上皮屏障的完整性,提供研究基礎。方法:1實驗性脈絡膜新生血管中Rap1表達的研究1.1 8-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠30只,雌雄不限,雙眼前節(jié)及眼底檢查均正常,隨機分為6組,每組5只,10只眼。分別為空白對照組、激光后3d組、激光后7d組、激光后14d組、激光后21d組、激光后28d組。1.2 CNV模型的建立:除空白對照組外,其他各組大鼠均采用氪激光建立CNV模型。參數(shù):波長647nm、光斑直徑200μm、功率260m W、曝光時間0.05s,圍繞視盤均勻光凝9~10個點,以見到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為標志。1.3分別于光凝后第3、7、14、21、28d進行熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA),活體觀察CNV的形成情況,測定CNV的發(fā)生率。1.4光凝后第3、7、14、21、28d造影后處死大鼠,摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取有明確血管化的激光斑處做切片,常規(guī)HE染色光鏡觀察各組標本視網(wǎng)膜脈絡膜的組織形態(tài)學改變,免疫組織化學法檢測Rap1的表達情況。1.5圖像分析與統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0軟件對所得各時間點顯微鏡下陽性染色率進行分析,觀察正常組織中Rap1及各時間點光凝組織中Rap1的表達差異。2實驗性脈絡膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表達的研究2.1 8-10周健康棕色BN大鼠30只,雙眼前節(jié)及眼底檢查均正常,隨機分為6組,每組5只,10只眼。分別為空白對照組、激光后3d組、激光后7d組、激光后14d組、激光后21d組、激光后28d組。除空白對照組外,其他各組大鼠均采用氪激光建立CNV模型。參數(shù):波長647nm、光斑直徑200μm、功率260m W、曝光時間0.05s,圍繞視盤均勻光凝9~10個點,以見到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為標志。2.2分別于激光后3、7、14、21、28d,隨機選取各組大鼠2只、4只眼,采用Western Blot蛋白水平檢測Rap1、GTP-Rap1、VEGF及β-catenin的表達情況。2.3分別于激光后3、7、14、21、28d,選取各組剩余大鼠,每組3只、6只眼,行Real-Time PCR方法檢測各組實驗性CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF及β-catenin基因的m RNA轉錄水平的變化情況。2.4采用SPSS19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結果:1實驗性脈絡膜新生血管中Rap1表達的研究1.1 FFA檢查:激光后14d光凝區(qū)出現(xiàn)大片圓盤狀熒光素滲漏;激光后21d有熒光滲漏的光凝斑數(shù)達到高峰;激光后28d熒光滲漏光凝斑數(shù)無明顯增加。1.2光鏡觀察:激光后7d發(fā)現(xiàn)光凝區(qū)形成早期的CNV;激光后21d,CNV呈顯著的纖維血管增殖,可見大量新生血管生成。1.3 Rap1在激光后3~28d的表達情況與空白對照組均為弱陽性表達,且無明顯變化,主要見于視網(wǎng)膜內(nèi)核層、外核層、視網(wǎng)膜色素上皮層、脈絡膜血管內(nèi)皮細胞胞漿、胞核。并且各組顯微鏡下統(tǒng)計陽性細胞個數(shù)及陽性細胞顯色分級,進行數(shù)據(jù)分析無統(tǒng)計學意義。2實驗性脈絡膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表達的研究2.1 Western Blot檢測結果:空白對照組Rap1表達情況與激光后不同時間點對比無明顯變化;空白對照組GTP-Rap1表達情況與激光后不同時間點對比明顯減少,且呈下降趨勢;VEGF在激光后7d、14d表達明顯增多,激光后21天達到表達高峰;激光后不同時間點各組中β-catenin的表達較空白對照組明顯增多,呈上升趨勢改變。組組之間采用pearson相關性檢驗,GTPRap1相對表達量與VEGF基因相對表達量的相關系數(shù)為:-0.956,為高度相關;與β-catenin基因相對表達量的相關系數(shù)為:-0.961為高度相關。2.2 Real-Time PCR結果顯示:Rap1在空白對照組及激光后各組中的表達不變。各組GTP-Rap1、VEGF及β-catenin基因數(shù)據(jù)均符合方差齊性和正態(tài)性分布。光凝后7d、14d、21d、28d,各組中GTP-Rap1、VEGF與空白對照組存在差異,均有統(tǒng)計學意義�？瞻讓φ战M中β-catenin與激光后不同時間點的表達差異均有統(tǒng)計學意義。組組之間采用pearson相關性檢驗,GTP-Rap1相對表達量與VEGF基因相對表達量的相關系數(shù)為:-0.913,為高度相關;與β-catenin基因相對表達量的相關系數(shù)為:-0.929為高度相關。結論:1 Rap1在正常組織及實驗性CNV中的表達情況無明顯改變,真正對視網(wǎng)膜色素上皮屏障功能起到調(diào)節(jié)作用的是活化的Rap1。2 GTP-Rap1在實驗性CNV中表達情況較正常大鼠明顯減少,與CNV的形成及發(fā)展存在相關性。3由于GTP-Rap1與VEGF、β-catenin表達呈負相關,我們推測激活Rap1在保持視網(wǎng)膜色素上皮屏障完整性及脈絡膜血管內(nèi)皮細胞遷移中有重要的調(diào)控作用。
【關鍵詞】：脈絡膜新生血管化 Rap1 GTP-Rap1 VEGF β-連蛋白 治療
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R773.4
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫12-13
• 引言13-15
• 第一部分 實驗性脈絡膜新生血管中Rap1 表達的研究15-29
• 前言15
• 材料與方法15-18
• 結果18-20
• 附圖20-24
• 討論24-26
• 參考文獻26-29
• 第二部分 實驗性脈絡膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表達的研究29-48
• 前言29
• 材料與方法29-36
• 結果36-38
• 附圖38-43
• 討論43-45
• 參考文獻45-48
• 結論48-49
• 綜述 脈絡膜新生血管的機制研究與治療進展49-59
• 參考文獻55-59
• 致謝59-60
• 個人簡歷60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王雨生;李夏;;脈絡膜新生血管性疾病聯(lián)合治療的效果及其存在的問題[J];眼科;2007年04期

  本文關鍵詞：實驗性脈絡膜新生血管中Rap1及相關因子表達的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：278279