本文關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1及相關(guān)因子表達(dá)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是多因素參與引起的復(fù)雜病理過(guò)程,與許多眼底疾病視力嚴(yán)重?fù)p傷密切相關(guān)。然而,由于對(duì)CNV的認(rèn)識(shí)起步較晚,其發(fā)病機(jī)制及臨床診斷、治療等方面尚存在很多亟待解決的問(wèn)題。在CNV發(fā)生過(guò)程中,視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞起著重要的調(diào)控作用,脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是CNV發(fā)生的靶細(xì)胞。正常狀態(tài)下,上述兩種關(guān)鍵細(xì)胞間存在著一個(gè)重要的屏障,即Bruch膜。Bruch膜一旦破壞,各種刺激因素可直接或通過(guò)RPE細(xì)胞間接作用于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而引發(fā)CNV。RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體的改變與CNV的形成有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),小分子G蛋白R(shí)as超家族的成員Rap1對(duì)細(xì)胞粘附連接完整性、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞屏障功能產(chǎn)生重要作用,且調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)一些促進(jìn)血管新生刺激因素的反應(yīng)。那么,Rap1是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜色素上皮屏障的完整性從而對(duì)CNV的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響呢?Rap1在CNV中的表達(dá)情況及其與CNV形成的相關(guān)性尚不明確,有待于實(shí)驗(yàn)研究加以證明。本研究采用激光誘導(dǎo)建立大鼠CNV模型,分別從組織病理學(xué)及分子病理學(xué)角度觀察Rap1、GTP-Rap1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和β-連蛋白(β-catenin)在實(shí)驗(yàn)性CNV中的表達(dá)情況,驗(yàn)證GTP-Rap1是否通過(guò)介導(dǎo)β-catenin的改變來(lái)影響視網(wǎng)膜色素上皮屏障的完整性,探討其在CNV發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制。為今后以Rap1為靶向鞏固視網(wǎng)膜色素上皮屏障的完整性,提供研究基礎(chǔ)。方法:1實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1表達(dá)的研究1.1 8-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠30只,雌雄不限,雙眼前節(jié)及眼底檢查均正常,隨機(jī)分為6組,每組5只,10只眼。分別為空白對(duì)照組、激光后3d組、激光后7d組、激光后14d組、激光后21d組、激光后28d組。1.2 CNV模型的建立:除空白對(duì)照組外,其他各組大鼠均采用氪激光建立CNV模型。參數(shù):波長(zhǎng)647nm、光斑直徑200μm、功率260m W、曝光時(shí)間0.05s,圍繞視盤(pán)均勻光凝9~10個(gè)點(diǎn),以見(jiàn)到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為標(biāo)志。1.3分別于光凝后第3、7、14、21、28d進(jìn)行熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA),活體觀察CNV的形成情況,測(cè)定CNV的發(fā)生率。1.4光凝后第3、7、14、21、28d造影后處死大鼠,摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取有明確血管化的激光斑處做切片,常規(guī)HE染色光鏡觀察各組標(biāo)本視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜的組織形態(tài)學(xué)改變,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Rap1的表達(dá)情況。1.5圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件對(duì)所得各時(shí)間點(diǎn)顯微鏡下陽(yáng)性染色率進(jìn)行分析,觀察正常組織中Rap1及各時(shí)間點(diǎn)光凝組織中Rap1的表達(dá)差異。2實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表達(dá)的研究2.1 8-10周健康棕色BN大鼠30只,雙眼前節(jié)及眼底檢查均正常,隨機(jī)分為6組,每組5只,10只眼。分別為空白對(duì)照組、激光后3d組、激光后7d組、激光后14d組、激光后21d組、激光后28d組。除空白對(duì)照組外,其他各組大鼠均采用氪激光建立CNV模型。參數(shù):波長(zhǎng)647nm、光斑直徑200μm、功率260m W、曝光時(shí)間0.05s,圍繞視盤(pán)均勻光凝9~10個(gè)點(diǎn),以見(jiàn)到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為標(biāo)志。2.2分別于激光后3、7、14、21、28d,隨機(jī)選取各組大鼠2只、4只眼,采用Western Blot蛋白水平檢測(cè)Rap1、GTP-Rap1、VEGF及β-catenin的表達(dá)情況。2.3分別于激光后3、7、14、21、28d,選取各組剩余大鼠,每組3只、6只眼,行Real-Time PCR方法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)性CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF及β-catenin基因的m RNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。2.4采用SPSS19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1表達(dá)的研究1.1 FFA檢查:激光后14d光凝區(qū)出現(xiàn)大片圓盤(pán)狀熒光素滲漏;激光后21d有熒光滲漏的光凝斑數(shù)達(dá)到高峰;激光后28d熒光滲漏光凝斑數(shù)無(wú)明顯增加。1.2光鏡觀察:激光后7d發(fā)現(xiàn)光凝區(qū)形成早期的CNV;激光后21d,CNV呈顯著的纖維血管增殖,可見(jiàn)大量新生血管生成。1.3 Rap1在激光后3~28d的表達(dá)情況與空白對(duì)照組均為弱陽(yáng)性表達(dá),且無(wú)明顯變化,主要見(jiàn)于視網(wǎng)膜內(nèi)核層、外核層、視網(wǎng)膜色素上皮層、脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿、胞核。并且各組顯微鏡下統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞顯色分級(jí),進(jìn)行數(shù)據(jù)分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表達(dá)的研究2.1 Western Blot檢測(cè)結(jié)果:空白對(duì)照組Rap1表達(dá)情況與激光后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比無(wú)明顯變化;空白對(duì)照組GTP-Rap1表達(dá)情況與激光后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比明顯減少,且呈下降趨勢(shì);VEGF在激光后7d、14d表達(dá)明顯增多,激光后21天達(dá)到表達(dá)高峰;激光后不同時(shí)間點(diǎn)各組中β-catenin的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增多,呈上升趨勢(shì)改變。組組之間采用pearson相關(guān)性檢驗(yàn),GTPRap1相對(duì)表達(dá)量與VEGF基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為:-0.956,為高度相關(guān);與β-catenin基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為:-0.961為高度相關(guān)。2.2 Real-Time PCR結(jié)果顯示:Rap1在空白對(duì)照組及激光后各組中的表達(dá)不變。各組GTP-Rap1、VEGF及β-catenin基因數(shù)據(jù)均符合方差齊性和正態(tài)性分布。光凝后7d、14d、21d、28d,各組中GTP-Rap1、VEGF與空白對(duì)照組存在差異,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？瞻讓�(duì)照組中β-catenin與激光后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組組之間采用pearson相關(guān)性檢驗(yàn),GTP-Rap1相對(duì)表達(dá)量與VEGF基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為:-0.913,為高度相關(guān);與β-catenin基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為:-0.929為高度相關(guān)。結(jié)論:1 Rap1在正常組織及實(shí)驗(yàn)性CNV中的表達(dá)情況無(wú)明顯改變,真正對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮屏障功能起到調(diào)節(jié)作用的是活化的Rap1。2 GTP-Rap1在實(shí)驗(yàn)性CNV中表達(dá)情況較正常大鼠明顯減少,與CNV的形成及發(fā)展存在相關(guān)性。3由于GTP-Rap1與VEGF、β-catenin表達(dá)呈負(fù)相關(guān),我們推測(cè)激活Rap1在保持視網(wǎng)膜色素上皮屏障完整性及脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移中有重要的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：脈絡(luò)膜新生血管化 Rap1 GTP-Rap1 VEGF β-連蛋白 治療
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R773.4
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫(xiě)12-13
• 引言13-15
• 第一部分 實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1 表達(dá)的研究15-29
• 前言15
• 材料與方法15-18
• 結(jié)果18-20
• 附圖20-24
• 討論24-26
• 參考文獻(xiàn)26-29
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表達(dá)的研究29-48
• 前言29
• 材料與方法29-36
• 結(jié)果36-38
• 附圖38-43
• 討論43-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 結(jié)論48-49
• 綜述 脈絡(luò)膜新生血管的機(jī)制研究與治療進(jìn)展49-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王雨生;李夏;;脈絡(luò)膜新生血管性疾病聯(lián)合治療的效果及其存在的問(wèn)題[J];眼科;2007年04期

  本文關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中Rap1及相關(guān)因子表達(dá)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：278279